動物實驗中嗅覺評估方法概述
【摘要】 嗅覺功能目前正受到越來越多的關注，在動物實驗中出現(xiàn)的嗅覺評估方法很多，但是目前為止還沒有一個**、客觀、高特異性的金標準方法出現(xiàn)，本文就目前動物實驗中的常見的嗅覺評估方法(包括行為學、影像學、電生理學、組織形態(tài)學等多種類型的實驗方法)進行一個概括性的介紹并簡單分析其優(yōu)缺點。
【關鍵詞】 嗅覺; 嗅覺障礙; 評估方法; 動物實驗; 文獻綜述
嗅覺是人體原始的感覺功能之一，它同視覺、聽覺一樣，是人體捕獲外界信息的特殊裝置。嗅覺還可以通過**神經系統(tǒng)影響人的情緒、調節(jié)生命周期。嗅覺障礙患者對周圍的事物不感興趣，反應平淡，生活質量下降，更可以造成精神上的壓抑或憂郁。王鴻等[1]報道用T&T測試法測試了1 035例慢性鼻竇炎鼻息肉患者，86.3%的患者有嗅覺功能障礙，與患者的主訴有極顯著的差異，說明嗅覺功能改變沒有受到患者的注意。近幾年隨著人們對生活質量要求的提高，對嗅覺障礙的關注程度有了很大的提高。
嗅覺評估不僅僅是要判斷嗅覺功能是否正常，還需要進一步判斷嗅覺障礙的程度、性質、部位等因素，如果能提示病因以及預后則更有臨床、實驗應用的價值。在動物實驗中關于嗅覺功能的研究已經有了較長的歷史，出現(xiàn)了多種實驗方法，但是目前為止還沒有一個**、客觀、高特異性的金標準方法出現(xiàn)，本文就目前動物實驗中的常見的嗅覺評估方法進行一個概括性的介紹。
1 行為學方法
動物實驗和臨床試驗的*大區(qū)別在于動物無法準確地和實驗者交流，所以行為學方法在動物實驗中就顯得極為重要。嗅敏動物的學習記憶能力、尋食能力等與嗅覺有很高的相關性，可以觀察、記錄其行為學的改變，從而判斷其嗅覺功能的變化。目前報道較多的可以評估嗅覺功能的行為學方法有以下幾種。
1.1 埋藏食物小球實驗(buried food pellet test，BFPT)
BFPT是目前*常用于檢測動物嗅覺功能的行為學檢測方法[2]。目前比較通用的方法由Nathan等[3]于2004年報道，他的實驗中使用找尋食物小球等待時間作為數據進行統(tǒng)計分析，即從小鼠被隨機放置于盒子中開始，到小鼠揭開食物小球并用它的前爪或牙齒抓住食物小球的時間，如果5 min(300 s)內小鼠未找到食物小球，即被移走。林靜等[4]以300 s(5次測試的平均值)內未找到食物小球作為判定小鼠存在嗅覺功能障礙的標準，并認為以300 s作為分組標準是合理的。
1.2 嗅覺測量儀
Slotnick等[5]利用行為學原理設計出一種用于動物實驗的嗅覺測量儀，可以通過改變氣味的濃度后觀察動物的行為學變化來評價其嗅覺。該系統(tǒng)經眾多實驗驗證其對動物嗅覺的檢測是有效的，因操作方便且可進行多種設計，此方法被廣泛應用于動物嗅覺功能的評估。
1.3 雙瓶實驗
有研究證實小鼠、大鼠在分辨某些物質的時候主要是依賴于嗅覺而非味覺，例如鹽酸、鹽酸奎寧(quinine HCl, QHCl)等有一定揮發(fā)性的物質 [7]。因嗅覺障礙時動物分辨飲用水和實驗溶液的能力下降，通過兩種溶液被動物飲用的程度可以評估動物嗅覺障礙的程度。
1.4 幼鼠超聲發(fā)聲實驗
新生小鼠嗅覺的產生比其他的感覺要早。新生小鼠嗅到成年鼠窩的氣味時可發(fā)出一種超聲作為回應，檢測這種超聲的出現(xiàn)與否可以判斷其嗅覺功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3甲基吲哚來破壞新生小鼠的嗅上皮，結果成功地證實了該檢測方法的可行性。而且在該實驗中發(fā)現(xiàn)由于被破壞嗅覺的小鼠無法正確識別**，其生存率大大降低，證明了嗅覺對新生小鼠有極其重要的作用。動物實驗中嗅覺評估方法概述
行為學方法在動物實驗的嗅覺評估中有很重要的作用，歷史悠久、技術成熟，實驗方法較為簡單，實驗裝置花費較少，對嗅覺功能的初步評估價值較為肯定(尤其是埋藏食物小球實驗和Slotnick的嗅覺測量儀)，可行性及可重復性較高。需要注意的是本類實驗受個體差異影響較大，實驗前應經預評估剔除先天差異比較大的個體，而且樣本量不宜過小，有時候還需對動物進行預先的訓練。為保證實驗的客觀性，需要很好地進行實驗設計與控制，有時連晝夜節(jié)律等變化的影響都需要考慮在內。行為學測試結果對嗅覺功能評估只是一個綜合的結果，對嗅覺障礙程度、部位等的判斷較差，如果能結合嗅覺誘發(fā)電位等客觀檢查可以做到更加客觀、可信。在過去的實驗中行為學測試往往與組織學檢查相結合，既增加了實驗的客觀性，又為進一步研究嗅覺產生機制或嗅覺障礙的原因提供了基礎。
2 客觀評估方法
嗅覺的感受、傳導是個比較復雜的過程，氣味分子通過鼻腔到達嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附，進而在黏膜層中擴散，到達嗅細胞。達到閾濃度的氣味分子可刺激嗅細胞產生嗅覺電位，這是其感受過程。產生的嗅覺電位通過嗅神經穿過篩骨篩板，到達嗅球，其內有第2級神經元，再通過嗅束傳導至初級嗅皮質及皮質內側核，而后至海馬回的內嗅皮層即次級嗅皮層，神經沖動引起大腦皮層的激活才能*后引發(fā)嗅覺。嗅覺功能的客觀評估方法包括了對嗅覺感受、傳導通路上各種指標，例如影像學、電生理學、組織學等的測量。目前動物實驗中使用較多的及可能有較大發(fā)展前景的客觀評估方法包括以下幾類。
2.1 組織學方法
這里的組織學是泛指解剖取組織后進行的所有檢查，包括大體解剖學、病理學、**學、分子生物學等諸多學科的檢查方法。嗅覺系統(tǒng)的改變既可以由病變本身引起也可以是因為嗅覺障礙后的退行性變引起。組織檢查比結構影像檢查更有評估價值，因其可以更好地提示病因，也利于更好地研究嗅覺通路和嗅覺障礙產生的機制。目前組織學方法在動物實驗中有很廣泛的應用，從部位選擇上看整個嗅覺傳導通路包括從嗅黏膜直到海馬回的內嗅皮層都有報道，從實驗方法上看更是復雜多樣，*常用的幾種方法有如下幾種。
2.1.1 病理學檢查 這是早期**學技術及分子生物學技術還不是很發(fā)達時常用的檢查手段，在早期嗅覺研究中有較多的應用，在嗅覺障礙的動物標本上可以看到細胞凋亡、空泡等變化，雖然特異性較差，但是也能提供宏觀的信息，現(xiàn)在常常和其他檢查方法一起使用，例如在陳志宏等的實驗中在進行其他檢查之前使用了HE染色方法檢查了模型小鼠的嗅上皮，發(fā)現(xiàn)其嗅上皮變薄，其中的感覺神經元的細胞核層數變少[9]。
2.1.2 蛋白及核酸表達的檢查 對相應組織中某些標志性蛋白及核酸的檢查可以間接地反映嗅覺功能及提示嗅覺障礙的原因。例如用**組化方法檢查嗅覺通路中嗅標記蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羥(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、cFos蛋白等標記物在許多文獻中都有記載。Buron等[10]在丙酮吸入誘導的嗅覺障礙實驗中使用了嗅上皮組織的OMP及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為觀察指標，發(fā)現(xiàn)丙酮對于嗅上皮的損傷是有選擇性的。有學者使用多巴胺及細小白蛋白作為標記物進行**組化檢查，發(fā)現(xiàn)失嗅動物模型的嗅球中含多巴胺及細小白蛋白的神經元細胞數量明顯減少，認為通過該失嗅動物模型可以對嗅球萎縮進行定量描述，提示多巴胺及細小白蛋白在嗅球中的表達對于失嗅的作用[11]。cFos蛋白可反映大腦組織活動程度，對cFos蛋白的觀察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。
2.2 電生理學方法
2.2.1 嗅電圖 將電極直接置于嗅區(qū)黏膜，當其接受嗅素刺激時記錄到的一種慢相負性電位變化稱為嗅電圖，目前普遍認為它是單個嗅細胞電位變化的總和，嗅電圖已經在動物實驗中得到證實[13]。嗅電圖*大的缺陷在于雖然其對嗅黏膜損傷引起的嗅覺障礙有較大的意義，但是對于黏膜后傳導通路以及嗅球、海馬回等**病變導致的嗅覺障礙沒有什么評估價值。動物實驗中嗅覺評估方法概述
2.2.2 嗅覺腦電圖 嗅覺誘發(fā)腦電圖是指在給予嗅刺激時，實驗對象的腦電圖可發(fā)生變化，Hirano等[14]用狗做實驗時成功地獲得了該變化，在他的實驗中發(fā)現(xiàn)腦電圖的快波對嗅覺功能的意義較大。嗅覺誘發(fā)腦電圖又相繼在大鼠等其他動物身上得到了驗證[15]。嗅覺腦電圖產生的機制還不是很明確，而且其特異性不是很高，故目前在動物實驗中研究、應用的較少。
2.2.3 嗅覺誘發(fā)電位 又稱為嗅覺事件相關電位(olfactory eventrelated potentials,OERP)，*早是用電刺激動物嗅黏膜時在頭皮特定部位記錄到穩(wěn)定的腦電位的變化，該方法經過一段時間的發(fā)展后認為其和自然嗅覺之間有一定的差距，故逐漸被化學氣味誘導的嗅覺誘發(fā)電位所取代，目前使用的已經比較少。早期化學氣味刺激除了有嗅覺刺激外還常常伴有物理刺激及對三叉神經的化學刺激，這些非嗅刺激干擾了正常嗅覺誘發(fā)電位的獲得。隨著僅能興奮嗅覺系統(tǒng)而不興奮三叉神經系統(tǒng)的化學物質如香草醛等，以及Kobal式嗅覺刺激器的出現(xiàn)，嗅覺誘發(fā)電位研究成為嗅覺研究領域的熱點。嗅覺誘發(fā)電位儀至少包括嗅覺刺激器及腦電采集系統(tǒng)，測量時需要在電聲屏蔽室進行，且需要給予一定的白噪聲掩蔽刺激探頭釋放刺激時產生的干擾噪聲。目前動物嗅覺誘發(fā)電位各波的具體來源以及與**間的相互關系還不清楚，嗅覺誘發(fā)電位的出現(xiàn)是否意味著動物確實產生了嗅覺還不能肯定，所以用來證明嗅覺傳導通路是否暢通比較可行[16]，而暫不能用于嗅性**的定位、定性診斷。嗅覺誘發(fā)電位應該是*可能成為動物嗅覺評估客觀標準的檢查方法。
3 影像學方法
3.1 嗅覺系統(tǒng)結構影像檢查
有研究證明嗅球及嗅束等神經結構的生長與周圍神經沖動的輸入有關[17]，所以嗅覺障礙后嗅覺系統(tǒng)各部位可有一定的不依賴于年齡的結構改變，通過磁共振影像檢查可以發(fā)現(xiàn)這些改變，例如嗅球體積變小、嗅溝缺失或變淺、嗅束缺失等現(xiàn)象，從而間接評價嗅覺功能。
3.2 嗅覺系統(tǒng)功能影像檢查
這是目前嗅覺研究的熱點方向之一，主要技術有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和腦信號的光學成像等。
3.2.1 功能磁共振檢查 功能磁共振檢查技術有很多，用于嗅覺系統(tǒng)功能的fMRI技術主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI)，當氧合血紅蛋白的比例增加時或去氧血紅蛋白含量減少時，T2信號縮短效應減弱，表現(xiàn)為MR信號增強。嗅覺功能成像既能反映血流的變化，也能反映神經元活動的代謝變化，近些年在研究神經功能方面發(fā)揮著巨大的作用，特別是fMRI無放射暴露，可反復測試，且時間、空間分辨率要優(yōu)于PET成像，故是目前嗅覺功能成像的主要方法。在大鼠實驗中已經證實，7 T的fMRI能夠顯示氣味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空間分辨率很高，對于研究嗅覺相關皮層的定位、嗅覺功能障礙情況下嗅覺相關皮層反應的變化等有極大的應用價值。有學者擬通過信息技術將嚙齒類動物嗅球的激活圖像編成二維的氣味圖(OdorMap，OM)及氣味圖數據庫(OdorMap Database，OMDB)以利于嗅覺工作者對嗅覺系統(tǒng)的研究[18]。功能磁共振應用在動物實驗的嗅覺評估中需要注意的是：首先動物是不能配合磁共振檢查的，故需要在麻醉下進行;其次磁共振是強磁場環(huán)境，故嗅覺刺激裝置不能由金屬制成。
3.2.2 腦功能光學成像 腦功能光學成像是近年來神經外科的熱點研究方向，目前主要的實驗技術有激光散斑襯比成像和內源信號光學成像。而應用于嗅覺功能檢查的主要是內源信號光學成像，這里所指的內源信號，并不是神經元所表現(xiàn)出來的電信號，而是指由神經元活動所引起的有關物質組分、運動狀態(tài)的改變而導致其光學特性的變化，在與某些特定波長的光量子相互作用后，得到的包含了這些特性的光信號，包括：血紅蛋白信號、氧合血紅蛋白信號、光散射特征信號等[1920]。許多生理性過程如血紅蛋白氧合度、細胞色素的氧合狀態(tài)、神經膠質和神經元腫脹、功能性血流量改變等變化，都會影響到組織光反射特性的改變。通過探測反射光的變化量，就可以獲得這種特異性的內源光學信號。內源光學信號成像在動物實驗中已用于多種腦功能皮層功能的檢查，比如視覺(貓、小鼠等)、軀體感覺皮層(大鼠、貓、松鼠猴等)、聽覺皮層(南美栗鼠、貓、雪貂等)。Bathellier等[21]在實驗中使用了內源光學信號原理和突觸素熒光標記兩種方法分別獲得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情況，在內源光學信號成像下，激活的嗅小球反光率下降，呈相對的冷色調，而在熒光標記實驗中激活區(qū)域熒光反應較強。雖然內源光學信號成像的時空分辨率都較高，但是其穿透腦皮層的能力受限(大約數百微米)，所以對于深層腦組織的觀察就沒有什么效果了。由于內源光學信號的確切生理來源至今沒有定論，所以為了闡述內源光信號對應的生理意義及其與神經元電活動的關系，還需要與其他方法進行對比研究。動物實驗中嗅覺評估方法概述
從其他感覺的評估方法來看，功能磁共振和誘發(fā)電位是研究的發(fā)展方向，但目前嗅覺產生、傳導機制尚未完全明了，相關檢查技術尚處于起步階段，還需要進行大量的研究。目前的嗅覺研究可以根據不同的實驗要求及實驗條件選擇不同的實驗方法及實驗方法的組合。嗅覺誘發(fā)電位及功能磁共振檢查由于其初期投入較大，對硬件及技術條件要求較高，開展難度較大，在國內只有少數醫(yī)院在從事這方面的實驗。行為學方法操作簡單，技術成熟，效果肯定，有很強的實用價值。組織學方法對于機理的研究十分重要，并且隨著對嗅覺認知的加深，越來越多的標記物被發(fā)現(xiàn)，評估方法也越來越豐富。如果可以出現(xiàn)一種簡單易行的嗅覺評估方法，那么可以極大地促進嗅覺的研究。
