Morris水迷宮實驗主要測定空間學(xué)習(xí)記憶能力，主要的實驗內(nèi)容有隱蔽站臺試驗、空間探索試驗、反向試驗和可視站臺試驗等。在這里主要介紹下文獻(xiàn)里面主要做的隱蔽站臺試驗和空間探索試驗的流程準(zhǔn)則。Morris水迷宮對卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)與記憶的影響

嚙齒類動物**次游泳時,一般不會找到藏于水面下的不可見的站臺。若動物在入水游泳60～90s以內(nèi)仍未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺時,實驗人員可將動物引導(dǎo)置于站臺上站立10～30s,使動物體會站在站臺上的感覺,這樣從**次開始,學(xué)習(xí)成績就能迅速提高。動物爬上站臺后,讓動物在站臺上站立5～10s。將大鼠從站臺上拿下來,休息30～60s以后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。在一般情況下,正常大鼠在經(jīng)過4～6個實驗日訓(xùn)練后,很快就學(xué)會以*快*佳的軌跡搜索到站臺的確切位置。

每天開始時，將鼠任意從四個象限（東北、西北、東南、西南）之一面向池壁放入水中，站臺放置于東南象限， 每次實驗鼠共游泳60～90s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，鼠可以得到在站臺上的10～30s休息時間；如果60～90s內(nèi)未能成功的找到站臺，就由實驗人員將鼠人工置于站臺上，且同樣給予10～30s的休息時間。有時鼠可能會在10～30s間隔時間到達(dá)之前從站臺上掉下或跳入水中繼續(xù)游泳。一旦這種情況發(fā)生，則將鼠重新放回站臺，并重新計時，使時間間隔到達(dá)（10～30s）。這樣可以確保每只鼠在每次實驗后有相等的時間來觀察和獲取空間信息。

1 　材料和方法

1. 1 　 材料 　①動物 : 雌性 SD 大鼠 40 只 ( 第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心) , 體質(zhì)量 180 ～200 g. 飼養(yǎng)溫度22 ℃,12 h 光照 ,12 h 黑暗 ,允許自由飲水和攝食 ; ②** : 17 β 2 雌二醇 ( 17 2 βestradiol , E2) : 美國 Sigma 公司生產(chǎn) ; GST :第四軍醫(yī)大學(xué)**研究所 , 藥品批號 :20010110. 乙酰膽堿脂酶 ( Ache) 試劑盒由南京建成生物工程研究所提供. 其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑.Morris水迷宮儀器，XR-XM101型，上海欣軟信息科技有限公司提供。SuperMaze動物行為學(xué)分析軟件，由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1 . 2 　方法

1 . 2. 1 　動物分組制模 　 隨機(jī)分為 5 組 ,每組 8 只 : 假去勢組 ( Sham 組) ; 去勢組 ( 卵巢切除術(shù)組 , ovariecto2my , OVX) ; OVX + E 2 組 ; GST 高劑量組 ( OVX +GST 2 h) ; GST 低劑量兩組 ( OVX + GST 2 L ) . 適應(yīng)性飼養(yǎng) 5 d 后開始實驗. 全部大鼠在速眠新 ( 0. 3～0. 8mL/ kg) 腹腔注射麻醉下行手術(shù) , 假去勢組在開腹后去除卵巢周圍的脂肪組織后關(guān)腹 ; 其余各組行雙側(cè)OVX.

1. 2. 2 　給**法 　 術(shù)后 1 wk 開始灌胃給藥. 根據(jù)每日**處理劑量分為 5 組 : 假去勢組 ( Sham 組 , 生理鹽水 5 mL/ kg) ,OVX 組 (生理鹽水 5 mL/ kg) ,OVX+ E 2 組(400μ g/ d , E 2) ,OVX + GST 2h 組(50 mg/ kg) ,OVX + GST 2 L 組(25 mg/ kg) . 連續(xù)用藥 5 wk.

1 . 3 　行為學(xué)測試

1 . 3. 1 　實驗條件與儀器 　  水迷宮由上海欣軟信息科技有限公司制作，材質(zhì)采用ABS工程塑料（汽車、飛機(jī)外殼材質(zhì)）模具制作，水池上空通過一攝像機(jī)和計算機(jī)相連接. 水池直徑約160cm ,深約 50cm ,預(yù)先在水池內(nèi)注入清水 , 然后加入少許墨汁 ,使水變成不透明的灰色 , 再注入清水使水面高出平臺 2 cm ,水溫控制在 22 ℃ . 以沿水池邊緣相等分布的 4 個點作為起始點 ,這樣水池被分為 4個相同的象限 ( 四分之一圓) ,平臺位于某個象限的中間 ,在其他 3 個象限任選一個入水點. 實驗每日 2次 ,第 2 日的入水點與前一日采用不同的入水點 , 每次訓(xùn)練 120 s. 若大鼠在 120 s 內(nèi)尚未找到平臺 ,則將大鼠拿到平臺上并使它在上面停留 30 s ; 若大鼠在120 s 內(nèi)找到平臺 ,也讓其在平臺上停留 30 s ,這樣才結(jié)束一次訓(xùn)練. 采用北京杰日歐科技有限公司研制的 Morris 水迷宮檢測軟件系統(tǒng)自動跟蹤池內(nèi)大鼠的活動軌跡并記錄大鼠游泳時間、游泳速度及游泳距離等參數(shù).

1. 3. 2 　結(jié)果評價 　 當(dāng)測試軟件設(shè)定的訓(xùn)練時間已到或大鼠已經(jīng)爬上平臺 ,計算機(jī)停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動計算出大鼠在水池中所游過的路程 ,找到平臺時所需的時間即潛伏期. 我們以大鼠入水后找到平臺的游泳時間即逃避潛伏期 ( escape latency ,EL ) ,作為觀測指標(biāo). 120 s 內(nèi)未找到平臺的記為 120s. 連續(xù)訓(xùn)練 5 d ,第 6 日撤除平臺 , 進(jìn)行空間探索實驗 ,在原平臺象限的對側(cè)象限入水 ,記錄游泳軌跡.

1. 4 　 Ache 活性測定

1. 4. 1 　組織樣本的處理 　 大鼠結(jié)束 Morris 水迷宮試驗后次日斷頭處死 ,在冰浴上迅速剝離大腦皮層和海馬 ,準(zhǔn)確稱取皮層和海馬 ,加入預(yù)冷的生理鹽水 ,在冰浴中用勻漿器將腦組織勻漿 , 制成 10 g/ L 的組織勻漿 ,組織勻漿經(jīng) 4000 r/ min , 4 ℃離心 20 min ,取上清液 ,移入 E ppendorf 管 , - 70 ℃保存待測.Morris水迷宮對卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)與記憶的影響

1. 4. 2 　 Ache 的活性測定 　 參照試劑盒提供的試劑及方法進(jìn)行操作. 應(yīng)用 722 型紫外線分光光度儀.

1. 4. 3 　蛋白測定 　 采用 Bradfordf 法.統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用 x ± s 表示 ,采用 SPSS 10. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析 ,所用統(tǒng)計方法為單因素方差分析及重復(fù)測量資料方差分析.

2 　結(jié)果

2 . 1 　去除卵巢對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及 GST和雌**的作用

2. 1. 1 　各組大鼠 5 d 訓(xùn)練中潛伏期的變化 　 各實驗組隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加 ,每組平均逃避潛伏期在不斷縮短 , 但各實驗組間的逃避潛伏期無顯著性差異( P > 0. 05 , Tab 1) .

2. 1. 2 　空間探索實驗結(jié)果 　 撤除平臺后 , 大鼠在原平臺象限的對側(cè)象限入水 , 記錄 120 s 的游泳軌跡 ,分析大鼠在原平臺象限的記憶頻度及找到原平臺位置的游泳時間既逃避潛伏期 ,以此反映大鼠的空間記憶能力. 從 Tab 2 中可以看出 ,撤除平臺后 ,OVX 組大鼠游泳逃避潛伏期較 Sham 組較明顯延長 ( P <0. 05) ,其記憶頻度也較 Sham 組降低 ( P < 0. 05) ; 雌**組逃避潛伏期及記憶頻度較 OVX 組有顯著的變化 ; GST 組逃避潛伏期也較 OVX 組縮短 , 而記憶頻度也明顯增加 ( GST 2 L 組 , P < 0. 05) .