摘 要:目的:觀察4 周跑臺運動對慢性應激致抑郁大鼠空間學習記憶能力，血漿皮質(zhì)醇(Cortisol，cort)含量和海馬 CA1 區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotro-phic Factor，BDNF)表達的影響。方法:30 只 SD 大鼠隨機分為正常對照組、應激模型組及應激運動組，制作慢性不可預見性應激模型，用八臂迷宮實驗觀察各組大鼠學習記憶等行為學指標的變化，放射**法測試大鼠血漿 cort含量，**組織化學結(jié)合圖像半定量方法對海馬 CA1 區(qū)BDNF 神經(jīng)元的數(shù)量及面積進行測量和分析。結(jié)果:慢性應激致抑郁大鼠血漿 cort 含量增加，八臂迷宮實驗中應激大鼠完成八臂迷宮時間顯著延長，工作記憶錯誤次數(shù)、參考記憶錯誤次數(shù)及總記憶錯誤次數(shù)均顯著增加，海馬CA1 區(qū) BDNF 表達減弱。而長期跑臺運動可以顯著改善抑郁模型大鼠的學習記憶能力，血漿 cort 含量降低，海馬CA1 區(qū) BDNF 表達增強。結(jié)論:跑臺運動可改善抑郁模型大鼠的學習記憶能力，機理可能與長期運動降低抑郁大鼠的血漿 cort 水平、拮抗 HPA 軸功能亢進及增強海馬CA1 區(qū) BDNF 的表達有關。

關鍵詞:跑臺運動;抑郁大鼠;學習記憶;BDNF

抑郁癥(depression)是一種潛在的致命的精神障礙性**，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全球超過1.21 億人患有抑郁癥，它的發(fā)病與逐漸增大的各種壓力帶來的應激性事件有關。慢性不可預知性應激(Chronic UnpredictableStress，CUMS)是近年來國內(nèi)外應用*為廣泛的抑郁動物模型之一，它可模擬抑郁的核心癥狀、快感缺乏及行為絕望，目前被廣泛運用于抑郁癥的病理生理機制、抗抑郁**研發(fā)及作用機制的研究。研究發(fā)現(xiàn)學習記憶能力降低是抑郁癥狀的重要表現(xiàn)，許多實驗表明一定程度的應激可以引起大鼠及人類學習記憶能力的減退，而運動鍛煉能降低應激導致的嚙齒動物的焦慮行為，改善動物的認知功能，但機制尚不清楚。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是學習記憶和情緒整合的神經(jīng)**，其結(jié)構(gòu)損傷可能是抑郁癥患者情緒低落和學習記憶能力下降的基礎。BDNF(Brain DerivedNeurotrophic Factor)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一份子，對神經(jīng)元的發(fā)生、分化、存活和生長起著重要作用。近來研究顯示，BDNF 在抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)**的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，與焦慮、抑郁行為等有關。慢性應激引起海馬形態(tài)學的改變研究較多的區(qū)域為海馬 CA3 區(qū)，較少涉及海馬 CA1 區(qū)，而且研究認為海馬 CAl 區(qū)在動物的信息處理及空間記憶方面擔負著尤其重要的作用。因此，本實驗以海馬 CA1 區(qū)為研究重點，通過復制 CUMS 大鼠模型觀察跑臺運動4 周后血漿cort 水平，測試大鼠學習記憶能力及海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達的變化，探討跑臺運動改善抑郁模型大鼠學習記憶能力的可能機制。

1 材料與方法

1. 1 動物及分組

雄性健康成年 SD 大鼠 3 月齡 30 只，體重(200 ～220)克，室溫(20 ± 2)℃，濕度(55 ± 10)% ，12 h 晝夜循環(huán)光照。大鼠購回后適應環(huán)境1 周，將30 只大鼠隨機分為3 組:即正常對照組(C)、應激模型組(SM)及應激運動組(SE)，每組10 只，SM 組及 SE 組大鼠單獨喂養(yǎng)。

1. 2 慢性不可預知性應激模型

制備慢性中等不可預知應激抑郁動物模型。應激刺激為24h 禁水、5min 懸尾、2h 束縛應激、5min 冷水強迫游泳(水溫 4℃)、24h 禁食、晝夜顛倒、20min 電擊足底(0. 8A，每次持續(xù)4s、間隔 5min)，共 7 種刺激，每日 1 種，每天1 次，以上刺激順序隨機安排，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，且每種刺激在每一輪中出現(xiàn)的次序不同，連續(xù)4 周。非應激組大鼠除了必要的例行鼠籠清潔，不做任何干擾。

1. 3 跑臺訓練方案

①應激模型組大鼠從**周開始每天上午接受為期四周的 CUMS 程序。②應激運動組大鼠每天上午接受 1次 CUMS 程序，下午進行跑臺訓練。跑臺訓練前大鼠進行1 周適應性訓練，正式訓練時，每天下午進行跑臺運動，大鼠0 坡度跑臺運動4 周，第(1-2)周大鼠每天運動30min(10m/min ×3)，第3 周每天運動45min(15m/min ×3)，第4 周每天運動 60min(15m / min × 4)，跑臺訓練期間每個程序之間大鼠休息5min。跑臺訓練時不使用電擊裝置驅(qū)趕大鼠，以避免對大鼠施加**應激，為期4 周。③正常對照組:在整個實驗過程中，正常對照組大鼠除了必要的例行鼠籠清潔，不做任何干擾。

1. 4 八臂迷宮實驗程序

慢性應激刺激及跑臺訓練結(jié)束后**天，所有大鼠進行八臂迷宮實驗，實驗前大鼠先在迷宮中適應2d，每天2 次。適應時 3 至 4 只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物10min，適應后進行每天2 次的訓練。每次訓練中，八臂中只有四臂放置了食物(分別為1、3、5、7 號臂)，整個實驗過程均維持此順序。實驗前所有大鼠禁食 2d，正式實驗時將大鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)，中央?yún)^(qū)四周用鼠門關住，15s 后將門打開并開啟分析測試軟件，測試定時10min，大鼠可選擇進入任意一臂，以攝取食物。大鼠進入有食物的臂且攝取了食物為1 次正確選擇;分析記憶的記錄參數(shù)為錯誤選擇的次數(shù)，重新進入放食物臂或**次進入放食物臂而不攝取食物為工作記憶錯誤(workingmemory error，WME)，進入不放食物臂稱為參考記憶錯誤(reference memory error，ＲME)，兩者之和為總記憶錯誤(total memory error，TE)當大鼠將 4 臂食物吃完或 10min鐘后，實驗結(jié)束，記錄所需時間(TT)。

1. 5 腦組織的取材及**組織化學染色

八臂迷宮行為測試結(jié)束后即刻，每組大鼠經(jīng)腹腔注射****鈉(40mg/kg)麻醉，開胸(同時心臟取血 2ml測血漿 cort 含量)，經(jīng)常規(guī)灌注固定，石蠟包埋后常規(guī)腦組織切片，片厚5μm，進行 BDNF **組織化學染色(**組化檢測試劑盒為武漢博士德公司生產(chǎn))。將石蠟切片置于65℃烤箱中烤片1h，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，入3% H2O2－ 甲醇液，室溫孵育 30min，然后加入 BDNF 血清**抗體(兔 IgG，37℃孵育 1h)，0.1molPBS 洗 2min ×3，隨后加入生物素標記的羊抗兔抗體37℃孵育1h;接著入ABC 液，37℃孵育 1h，DAB 呈色、蘇木素輕度復染、裱片、脫水、透明、封片。

1. 6 大鼠血漿 cort 含量測試

八臂迷宮行為測試結(jié)束后即刻，灌注同時從大鼠左心房抽取2ml，將從每只大鼠抽出的2ml 血液4℃、3000r/min 離心 10min，分離血漿，轉(zhuǎn)移至一新離心管，置于 －70℃低溫冰箱中保存，采用常規(guī)放射**法測定大鼠血漿cort 含量。

1. 7 圖像分析和統(tǒng)計學處理

根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠海馬 CA1 的位置(圖1-2)，用數(shù)碼顯微鏡拍片，江蘇捷達形態(tài)學分析軟件對大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 陽性神經(jīng)元的表達進行分析，計數(shù) BDNF 陽性細胞個數(shù)及面積(400 倍)。采用 SPSSl8. 0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用 mean ± SD 表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVE)對組間差異進行統(tǒng)計，以 P ＜0.05 表示統(tǒng)計學上具有顯著性差異，P ＜0.01表示統(tǒng)計學上具有高度顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2. 1 大鼠八臂迷宮行為學測試結(jié)果

表2 結(jié)果顯示:與正常對照組比較，應激模型組大鼠完成八臂迷宮時間顯著延長(P =0.002)，工作記憶錯誤次數(shù)(WME)及參考記憶錯誤次數(shù)(ＲME)均顯著增多(P=0. 002，P =0. 043)，總記憶錯誤次數(shù)(TE)遠遠高于正常對照組(P =0.002);與應激模型組比較，應激運動組大鼠完成八臂迷宮時間顯著縮短(P =0.021)，ＲME 及TE 均顯著增多(P =0.026，P =0.032)，WME 與應激模型組大鼠比較無統(tǒng)計學意義(P =0.061)。

2. 2 各組大鼠血漿 cort 結(jié)果

表3 所示，與正常對照組比較，應激模型組大鼠血漿cort 含量顯著增加(P = 0. 003)，增加幅度為 97% ;經(jīng)過 4周跑臺運動，應激運動組大鼠血漿 cort 含量顯著降低(P=0. 049)，下降幅度為 27% ，提示長期跑臺運動可能通過拮抗慢性應激誘導的 HPA 軸功能亢進，從而達到抗抑郁目的。跑臺運動對抑郁模型大鼠學習記憶能力測試影響

2. 3 各組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達結(jié)果

從圖2 可見海馬CA1 區(qū)內(nèi)分布有大量BDNF，胞漿染色，胞核不染色，神經(jīng)元大小不一，呈散在分布，胞體形態(tài)多種多樣呈圓形或橢圓形，有的有較長的突起。

由表3 可知:與正常對照組比較，應激模型組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF **陽性細胞數(shù)量及面積均顯著減少(P=0. 001，P =0. 002)，降低幅度分別為44%及45%;經(jīng)過4周跑臺運動應激運動組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF **陽性細胞數(shù)量及面積均顯著增加(P =0.035，P =0.024)，增加幅度分別為45%及58%。

3 討論

3. 1 跑臺運動對抑郁模型大鼠血漿 cort 含量及學習記憶能力的影響

下丘腦 －垂體 －腎上腺軸(HPA)涉及人體的多種生理功能和病理變化如情感、代謝調(diào)節(jié)、應激反應等，HPA軸功能障礙被認為是情緒障礙的核心特征。當機體感受應激源時，HPA 軸興奮性提高，但若機體長期處于應激狀態(tài)，將嚴重影響人體的身心健康，使機體出現(xiàn)抑郁癥狀。大量研究顯示，抑郁患者血漿的促腎上腺皮質(zhì)**和皮質(zhì)醇均濃度升高，而經(jīng)抗抑郁**后隨著抑郁緩解兩者濃度下降。本實驗得到相同結(jié)果，經(jīng)過4 周慢性不可預知應激大鼠血漿 cort 水平均顯著增加，可能的原因，HPA 軸自身具有分泌**的功能，長期慢性應激可以促使下丘腦分泌 CＲH，CＲH 進一步刺激腦垂體分泌 ACTH，ACTH 刺激腎上腺皮質(zhì)**釋放糖皮質(zhì)**(cort)。cort是 HPA 軸重要**，過量的糖皮質(zhì)**能夠?qū)C體造成一定損害。研究認為，cort 是 HPA 軸重要**之一，與絕望、焦慮情緒及認知功能有關，而且 Ulloa 等研究發(fā)現(xiàn)嚙齒動物大腦重復注射 cort 可以引起動物抑郁樣及影響神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)。Ｒyan 等通過水迷宮證實束縛及冷水應激21 天大鼠學習記憶能力顯著下降。本實驗通過八臂迷宮實驗證實，大鼠經(jīng)過4 周慢性不可預知的應激，與對照組比較，應激模型大鼠完成八臂迷宮時間顯著延長，參考記憶、工作記憶錯誤次數(shù)及總錯誤次數(shù)顯著增加，學習記憶能力明顯下降，與以前多數(shù)學者研究結(jié)果一致。

研究表明，運動可以通過拮抗 HPA 軸功能亢進改善抑郁大鼠的學習記憶能力。我們的研究也證實了此觀點，4 周跑臺運動可以降低慢性應激致抑郁模型大鼠皮質(zhì)醇的過度分泌，八臂迷宮實驗中應激運動組大鼠完成八臂迷宮時間縮短，記憶錯誤次數(shù)顯著減少，學習記憶能力增強。結(jié)合血漿皮質(zhì)醇的實驗結(jié)果，我們認為跑臺運動通過拮抗HPA 軸減少大鼠皮質(zhì)醇分泌可能是運動改善抑郁癥大鼠空間學習記憶能力受損的機制之一。跑臺運動對抑郁模型大鼠學習記憶能力測試影響

3. 2 跑臺運動對抑郁模型大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達的影響

海馬是與學習記憶和情緒行為功能密切相關的重要腦區(qū)，也是應激易累及損傷的靶區(qū)，其與抑郁障礙的關系近年來受到關注，臨床研究提示抑郁癥患者海馬表現(xiàn)出神經(jīng)元萎縮和壞死，采用 MＲI 發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者雙側(cè)海馬的體積明顯小于正常人，并且海馬萎縮的程度與抑郁癥的病程成正比。而且研究證實，應激可以導致海馬 CA1區(qū)域的形態(tài)學改變，可能與海馬功能的損害有關。Sousa等發(fā)現(xiàn)不可預測的慢性應激既使大鼠海馬 CAl 區(qū)錐體細胞樹突總長度減少13%，大鼠學習記憶能力顯著下降。

神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF 在抑郁癥的發(fā)病機理中起重要作用，慢性不可預知的應激是近年來國內(nèi)外應用*為廣泛的抑郁動物模型之一，動物實驗表明，應激可以減少海馬 BDNF 的表達，而抗抑郁**可以阻止抑郁大鼠 BDNF水平的下降。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期慢性應激組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達明顯減弱，同時大鼠學習記憶能力顯著下降，可以推測慢性應激導致的海馬 CA1 區(qū) BDNF減少可能是大鼠學習記憶能力下降的病理機制之一。而應激運動組大鼠跑臺運動4 周后海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達明顯增強，提示慢性應激大鼠經(jīng)過長期跑臺運動八臂迷宮成績提高可能與海馬 CA1 區(qū) BDNF 表達增強有關?？赡艿脑?，海馬腦區(qū)是參與和調(diào)節(jié)應激的主要結(jié)構(gòu)，應激刺激的信息首先作用于海馬，并引起機體下丘腦促腎上腺皮質(zhì)**釋放因子(CＲH)的分泌導致 HPA 軸功能亢進，大鼠皮質(zhì)醇分泌增加。研究發(fā)現(xiàn)，應激引起的皮質(zhì)醇的分泌增多進而損害海馬各個分區(qū)結(jié)構(gòu)及功能和 BDNF的表達。海馬 CAl 區(qū)在學習記憶中擔負著尤其重要的作用，因此可以推測長期跑臺運動增強慢性應激大鼠學習記憶能力主要與此運動拮抗 HPA 軸功能抗進減少 cort分泌導致海馬 CAl 區(qū) BDNF 表達增強有關。跑臺運動對抑郁模型大鼠學習記憶能力測試影響