摘要：目的通過(guò)觀察微管相關(guān)蛋白－２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ?。幔螅螅铮悖椋幔簦澹洹。穑颍铮簦澹椋睿?，ＭＡＰ－２）表達(dá)的變化研究針灸結(jié)合康復(fù)法（以后簡(jiǎn)稱針康法）對(duì)海馬梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法將５０只清潔級(jí)雄性ＳＤ大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、針康組和康復(fù)組，每組各１０只。采用光化學(xué)法誘導(dǎo)大鼠海馬梗死造模型，術(shù)后２４ｈ給予干預(yù)，１４ｄ后采用Ｙ－型迷宮測(cè)試，評(píng)價(jià)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；采用**組化法觀察各組大鼠海馬中的ＭＡＰ－２表達(dá)情況。結(jié)果（１）與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。在Ｙ－迷宮試驗(yàn)中，與模型組比較，其余各組學(xué)習(xí)能力均有所恢復(fù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），且針康組優(yōu)于針刺組和康復(fù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。（２）與假手術(shù)組比較，各組大鼠的ＭＡＰ－２表達(dá)明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組相比其余各組表達(dá)更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），且針康組優(yōu)于針刺組和康復(fù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。結(jié)論針康法可促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)、上調(diào)ＭＡＰ－２的表達(dá)，效果均優(yōu)于單純的針刺和康復(fù)訓(xùn)練。

關(guān)鍵詞：學(xué)習(xí)記憶；ＭＡＰ－２；針刺；康復(fù)訓(xùn)練；腦梗死；大鼠

腦缺血導(dǎo)致患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙，其功能的恢復(fù)可通過(guò)再學(xué)習(xí)而獲得，但由于患者多同時(shí)存在記憶功能的障礙，嚴(yán)重影響患者提高自身的軀體運(yùn)動(dòng)功能，更影響其生活質(zhì)量。目前，針刺、康復(fù)訓(xùn)練**缺血后記憶能力障礙的效果較好，但相關(guān)作用機(jī)制還不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)以針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練作為干預(yù)手段，探討針灸結(jié)合康復(fù)的方法對(duì)海馬梗死大鼠的ＭＡＰ－２表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并試探性闡述其作用機(jī)制。

１　材料和方法

１．１　

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組所選試驗(yàn)動(dòng)物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)ｓｃｘｋ（京）２００９－０００１］，均為健康清潔級(jí)雄性ＳＤ大鼠，共５０只，體重

２００ｇ－２５０ｇ。將大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、針刺組、康復(fù)組和針刺結(jié)合康復(fù)組（簡(jiǎn)稱“針康組”），每組１０只大鼠。采用光化學(xué)法誘導(dǎo)海馬缺血模型。各組于術(shù)后２４ｈ進(jìn)行干預(yù)。

１．２　

主要儀器、試劑選購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的虎紅粉劑；由哈爾濱工業(yè)大學(xué)提供的冷光源；上海欣軟信息科技有限公司可提供Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮、Ｙ－型迷宮；購(gòu)自美國(guó)Ｓｔａｎｔ公司的ＭＡＰ－２一抗試劑盒，產(chǎn)品（批號(hào)２００５０７０）；購(gòu)自北京中山試劑公司的二抗試 劑 盒，產(chǎn) 品 （批 號(hào)２００５０１２）。

１．３　

制備模型

光化學(xué)法誘導(dǎo)法：用１０％水合氯醛按３５ｍｇ／ｋｇ腹腔注射將大鼠麻醉，于俯臥位將大鼠放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中將大鼠頭皮切開，暴露顱骨到前囟點(diǎn)，在前囟點(diǎn)后３．５ ｍｍ、中線向左旁開２．０ｍｍ處，用牙科鉆鉆開一個(gè)直徑為１ｍｍ的骨窗，將光纖管尾端探至硬膜下３．３ｍｍ處。用生理鹽水稀釋虎紅，濃度為１．５％，按７０ｍｇ／ｋｇ于腹腔注射，注射時(shí)間為２ｍｉｎ。５ｍｉｎ后照射局部海馬組織。照射時(shí)間５ｍｉｎ。手術(shù)結(jié)束后縫合頭皮，正常喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅進(jìn)行常規(guī)麻醉（沿頭顱切開頭皮，用牙科鉆在前囟后３．５ｍｍ、中線向左旁開２．０ｍｍ處鉆孔，然后縫合頭皮）。

１．４　

干預(yù)方法

針刺組：大鼠術(shù)后２４ｈ參照于致順頭部腧穴七區(qū)劃分法和《大鼠穴位針灸圖譜》，選擇０．２５ｍｍ×１５ｍｍ針具取頂區(qū)進(jìn)行針刺，進(jìn)針深度３－１０ｍｍ，留針６ｈ?？祻?fù)組：大鼠術(shù)后２４ｈ進(jìn)入Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮接受訓(xùn)練，從平臺(tái)所在象限外的其他３個(gè)象限，隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期。將大鼠面向池壁放入池中，如果大鼠２ｍｉｎ內(nèi)找不到平臺(tái)，就將大鼠放到平臺(tái)上停留３０ｓ，后將其放回籠中。此種情況潛伏期記為１２０ｓ。訓(xùn)練時(shí)依次從３個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，每次大鼠的入水點(diǎn)相同，訓(xùn)練的順序固定。每日訓(xùn)練１次。主要訓(xùn)練大鼠的游泳和學(xué)習(xí)記憶功能能力。針康組：大鼠術(shù)后２４ｈ后每日針刺留針６ｈ，Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮訓(xùn)練１次。模型組：術(shù)后自然恢復(fù)，不進(jìn)行任何干預(yù)。

１．５　標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

１．５．１　

標(biāo)本采集

干預(yù)１４ｄ后，于大鼠檢測(cè)行為能力后灌注取材。按大鼠０．３５ｍｌ／１００ｇ體重的劑量，腹腔注射１０％水合氯醛０．５ｍｌ，將大鼠深度麻醉，打開胸腔，暴露心臟，將灌注針刺入心尖，沿左心室將管插至主動(dòng)脈，固定插管，剪開右心耳，先灌注０．９％的生理鹽水，見右心耳流出澄清液體，再灌注２００ｍｌ，濃度為４％多聚甲醛固定液。完成灌注后將大鼠斷頭取腦，所取組織放于４％福爾馬林溶液中固定２４ｈ。２４ｈ后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（從視交叉水平開始進(jìn)行冠狀切片，厚度為５μｍ），采用**組織化學(xué)（Ｓ－Ｐ）法染色。

１．５．２　

指標(biāo)檢測(cè)

將包埋的腦組織切片，石蠟切片先經(jīng)二甲苯脫蠟，再梯度酒精脫水；取過(guò)氧化氫去離子水孵育，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；枸櫞酸微波修復(fù)。滴加一抗（１∶５０），４℃下冰箱過(guò)夜，ＰＢＳ沖洗，２ｍｉｎ×３次；滴加二抗，３７℃下孵育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ沖洗，２ｍｉｎ×３次；滴加ＤＡＢ顯色劑；后用蒸餾水進(jìn)行充分沖洗，蘇木素復(fù)染，用鹽酸乙醇分色、藍(lán)化；后梯度酒精脫水，二甲苯透明，*后中性樹膠封片。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，將制成切片置于放大鏡下（放大倍數(shù)為１０×４０）隨機(jī)選５個(gè)視野，顯色者為陽(yáng)性，對(duì)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

１．６　

評(píng)估學(xué)習(xí)記憶能力

采用Ｙ－型迷宮：Ｙ－型迷宮是一個(gè)三等臂式迷宮，每臂頂端設(shè)有信號(hào)燈，將**臂信號(hào)燈點(diǎn)亮，危險(xiǎn)臂不點(diǎn)亮信號(hào)燈。訓(xùn)練中每次無(wú)規(guī)則選取一**臂。大鼠在通電后從所在臂跑到亮臂記為正確，如跑到暗臂記為錯(cuò)誤。每天分段訓(xùn)練大鼠，每段１０次，兩段間隔２ｍｉｎ。如連續(xù)１０次測(cè)試中有９次正確表明大鼠已掌握迷宮結(jié)構(gòu)，記錄大鼠掌握迷宮結(jié)構(gòu)所需的訓(xùn)練次，表明學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)的大鼠訓(xùn)練次數(shù)越少。以此可判斷大鼠學(xué)習(xí)分辨能力。

１．７　

統(tǒng)計(jì)方法

采用ＳＰＳＳ?。保罚敖y(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ珚±ｓ）表示，各組組間差異采用單因素方差分析，以Ｐ＜０．０５為有顯著性差異。

２　結(jié)果

２．１　

學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估

Ｙ－迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠的分辨學(xué)習(xí)能力明顯下降（與假手術(shù)組比較），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，干預(yù)組學(xué)習(xí)能力均有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），且針康組療效*佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），見表１。

２．２　

**組化檢測(cè)海馬

ＭＡＰ－２的表達(dá)梗死灶周圍ＭＡＰ－２陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。各組大鼠的ＭＡＰ－２表達(dá)較假手術(shù)組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，各干預(yù)組表達(dá)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），針康組*佳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），見表２。

３　討論

頭針作為一種整體性**配合康復(fù)**，使患者的大腦皮層在單位**時(shí)間內(nèi)獲得更大的刺激量，激發(fā)大腦皮層相對(duì)無(wú)效的或新形成的通路，使原先未承擔(dān)此功能的結(jié)構(gòu)去承擔(dān)新的、不熟悉的任務(wù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦的重塑。臨床實(shí)踐中我們也發(fā)現(xiàn)，針灸結(jié)合康復(fù)之路可同時(shí)提高患者的肢體運(yùn)動(dòng)能力及認(rèn)知能力，兩方面功能的提高均優(yōu)于單純的針灸或康復(fù)訓(xùn)練，尤其是頭針**（其中以前額部腧穴為主）療效*為突出?？梢姡樋捣▽⒏纳苹颊咧w運(yùn)動(dòng)功能及學(xué)習(xí)功能，這正符合現(xiàn)代偏癱康復(fù)中的提高運(yùn)動(dòng)整合水平的理念。目前，針灸配合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的**方法在臨床已取得良好療效，被稱作“新趨勢(shì)針灸”（ＮＴＡ）。本實(shí)驗(yàn)采取術(shù)后２４ｈ干預(yù)１４天，是因?yàn)橛醒芯勘砻?，腦缺血后神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)發(fā)生可能在１周以后，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)其生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。

ＭＡＰ－２是一種熱穩(wěn)定的磷蛋白，哺乳動(dòng)物腦中含量豐富，是神經(jīng)細(xì)胞的骨架成分，主要在神經(jīng)元胞體、樹突和樹突棘表達(dá)，能調(diào)節(jié)微管蛋白組裝，是動(dòng)力學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，常被用來(lái)作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白。根據(jù)Ｂｒｉｏｎｅｓ等研究發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血后的大鼠的表達(dá)增加，并同時(shí)表現(xiàn)出大鼠在水迷宮行為學(xué)參數(shù)的變化，提示ＭＡＰ－２可能發(fā)揮了提高神經(jīng)功能的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后大鼠的分辨學(xué)習(xí)的能力明顯下降。針刺、康復(fù)訓(xùn)練以及針刺結(jié)合康復(fù)均能促進(jìn)學(xué)習(xí)能力的恢復(fù)，但針康法療效*佳。**組化結(jié)果 顯示，與假手術(shù)組 比較，各組 大鼠的ＭＡＰ－２表達(dá)均較對(duì)照組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，受干預(yù)組表達(dá)更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０５），且針康組效果*明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞０．０５）。表明單純康復(fù)訓(xùn)練、單純針刺與針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練均能明顯促進(jìn)神經(jīng)元樹突發(fā)芽和再生，進(jìn)一步促進(jìn)新的突觸形成，而后者作用更明顯。本實(shí)驗(yàn)中ＭＡＰ－２蛋白表達(dá)增加的同時(shí)有腦梗死大鼠行為學(xué)的改善，并且與學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)呈正相關(guān)。表明針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練可明顯促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能，改善學(xué)習(xí)記憶能力。進(jìn)而促進(jìn)其軀體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的效率，提高生活質(zhì)量。在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們爭(zhēng)取能夠?qū)δX卒中患者的其他功能康復(fù)做更為廣泛的深入研究。