［摘要］ 目的研究甲狀腺素、硫辛酸及兩藥聯(lián)合**對甲狀腺功能減退大鼠認知功能損傷的改善，以及血清、海馬組織中超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、丙二醛( malondialdehyde，MDA) 的變化。方法 成年 SD 雄性大鼠50 只，每組10 只，隨機分為5 組，對照組、甲減組［丙硫氧嘧啶( PTU) 組］、左甲狀腺素鈉( L-T4) 組( PTU + L-T4 組) 、硫辛酸( LA) 組( PTU + LA 組) 、聯(lián)合用藥組( PTU + L-T4 + LA 組) 。8 周后以 Morris 水迷宮試驗檢測大鼠空間學習記憶能力，采用黃嘌呤氧化酶法測定血清和海馬組織 SOD 活力，采用硫代***酸法測定血清和海馬組織MDA 含量。結果 與對照組比較，PTU 組定位航向?qū)嶒炋颖軡摲诿黠@延長，差異有統(tǒng)計學意義( P ＜ 0． 05) ; 空間探索能力成績降低，但差異無統(tǒng)計學意義; SOD 活性降低( P ＜ 0． 001) ，MDA 含量升高( P ＜ 0． 001) 。與 PTU 組比較，PTU + L-T4 組、PTU + LA 組、PTU + L-T4 + LA 組大鼠逃避潛伏期均縮短，SOD 活力升高，MDA 含量降低( P ＜0． 05) 。結論 LA 和 L-T4 聯(lián)合**改善氧化應激，顯著改善甲狀腺功能減退大鼠的認知功能。

［關鍵詞］甲狀腺功能減退癥; 海馬; 認知功能; 甲狀腺**

甲狀腺功能減退癥( 甲減) ，指血清甲狀腺**水平低于正常范圍，是一種常見的*****。甲狀腺**不僅在**神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟和功能維持中起重要作用，而且參與**認知功能。研究發(fā)現(xiàn)，甲減可引起認知功能減低、學習記憶能力下降，更被認為是癡呆的一種危險因素。本研究通過抗氧化劑和甲狀腺**聯(lián)合**觀察甲減模型大鼠學習記憶能力、空間探索能力的改善，通過氧化應激及抗氧化應激相關指標超氧化物歧化酶( superox-ide dismutase，SOD ) 和 丙 二 醛( malondialdehyde，MDA) 的變化，闡述抗氧化劑對甲狀腺功能減退大鼠抗氧化應激能力的改善。

1 材料與方法

1． 1 動物模型

采用成年清潔級 Sprague-Dawley 雄性大鼠 60只( 190 ± 15) g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心( 生產(chǎn)許可證號 2011-002) 。飼養(yǎng)環(huán)境: 標準鼠籠分籠飼養(yǎng)，每籠 5 只，自由攝食飲水，自然光照，溫度( 23 ±2) ℃，相對濕度( 45%～ 50%) 。所有大鼠適應性飼養(yǎng) 7 d 后隨機預留 10 只作對照組，正常飲水，其余 50 只納入實驗誘導甲減模型，飲用水中加入含有 0． 05% ( W/V) 丙硫氧嘧啶( propylthiouracil，PTU) ，每周稱取大鼠體質(zhì)量。4 周后，模型組大鼠出現(xiàn)行動遲緩、反應遲鈍、飲食飲水量較前減少，體質(zhì)量增加緩慢，隨機選取 10 只，經(jīng)腹主動脈取血檢測甲狀腺功能。

1． 2 **干預

甲減模型建成后，除對照組外，將 40 只甲減大鼠隨機分為 4 組進行干預**。包括: 甲減組( PTU組) 、硫辛酸( lipoic acid，LA) 組( PTU + LA 組) 、左甲狀腺素鈉( levothyroxine sodium，L-T4) 組( PTU +L-T4 組) 、聯(lián)合用藥組( PTU + L-T4 + LA 組) 。每天8∶ 00 PTU + L-T4 + LA 組、PTU + L-T4 組按 0． 02 μg /g L-T4 灌胃，其余各組按等量生理鹽水灌胃; 18∶ 00PTU + LA 組和 L-T4 + LA 組按 120 mg / kg LA 灌胃，其余各組按等量生理鹽水灌胃。連續(xù) 4 周，期間除對照組飲用**無菌水外其余各組繼續(xù)飲用0． 05%( W/V) PTU 水。

1． 3 主要試劑和儀器

PTU 由上海朝暉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)( 產(chǎn)品批號1205F13) 。LA 由江蘇萬禾制藥有限公司提供 ( 產(chǎn)品批號 110401) 。L-T4 由德國 Merck 公司生產(chǎn)( 產(chǎn)品批號 145574) 。SOD、MDA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Morris 水迷宮系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司提供) 。MultiskanMK3 型酶標儀( 荷蘭雷勃公司產(chǎn)品) 。

1． 4 行為學檢測

**干預 3 周后所有大鼠行 Morris 水迷宮行為學測試，檢測大鼠認知及記憶能力。實驗期間，室內(nèi)光照盡量保持一致，迷宮周圍物品及空間線索保持固定不變。實驗內(nèi)容包括: ①適應性訓練: 實驗前3 d每天讓動物在無**平臺的水中適應性游泳;②定位航行實驗: 實驗歷時 5 d，每天下午將大鼠面向池壁，分別從 4 個入水點放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)找到平臺的時間 ( 逃避潛伏期 ) ，如果在120 s內(nèi)未找到平臺，潛伏期記為 120 s，由操作者幫助大鼠找到平臺，并在平臺中央停留 10 s，實驗后將大鼠放回籠中; ③空間探索實驗: 第 6 天撤去平臺，將大鼠由任一入水點下水，記錄 120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺所在象限的時間、平均速度和總路程及穿越平臺所在區(qū)域的次數(shù)。

1． 5 標本采集與制備

各組大鼠按每 100 g 體質(zhì)量 10% 水合氯醛0． 3 ml 麻醉，仰臥固定在手術板上，常規(guī)**，腹部正中切口，經(jīng)腹主動脈取血，普通離心機 3500 r/min離心后取上層血清分為兩份，一份于 4℃ 冰箱保存待測三碘甲腺原氨酸( triiodothyronine，T3) 、甲狀腺素( thyroxine，T4) 、促甲狀腺素( thyrotropin，TSH) ，另一份于 －20℃冰箱保存待測 SOD、MDA。大鼠取血后斷頭處死，迅速在冰盤上剝?nèi)ワB骨后，以打孔方式( 15 gauge) 取出海馬組織，以 4℃預冷的生理鹽水洗去余血，置于液氮中冷凍，保存于 － 80℃ 低溫冰箱。檢測海馬組織相關指標時，取出海馬組織，準確稱量后按 1∶ 9( W/V) 比例在 0． 9% 生理鹽水中勻漿制成 10%海馬組織勻漿懸液，用于海馬組織 SOD、MDA 的測定。

1． 6 甲狀腺**和氧化應激指標檢測方法

采用化學發(fā)光法測定 T3、T4、TSH 水平。采用黃嘌呤氧化酶法測定 SOD 活性，采用硫代***酸法測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA 含量。所有實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

1． 7 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17． 0 進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以x珋 ± s 表示，大鼠 Morris 水迷宮行為學數(shù)據(jù)分析采用重復測量設計方差分析，**次入水成績及平均成績比較采用單因素方差分析，其他相關測試指標均采用單因素方差分析和析因設計資料的方差分析。

2 結果

2． 1 各組大鼠甲狀腺**水平比較

與對照組比較，PTU 組、PTU + LA 組 T3、T4 水平明顯下降，TSH 水平明顯升高( P ＜0． 01) ; PTU +L-T4 組、PTU + LT-4 + LA 組，雖然 T3、T4 均有所降低，TSH 有所升高，但比較無明顯統(tǒng)計學意義。與PTU 組比較，PTU + L-T4 組、PTU + L-T4 + LA 組 T3、T4 升高 TSH 降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 組與 PTU組比較，差異無統(tǒng)計學意義( 表 1) 。

2． 2 各組大鼠 Morris 水迷宮行為學測試成績比較

2． 2． 1 用單因素方差分析比較大鼠定位航向?qū)嶒灣煽?/span>

2． 2． 1． 1 每日大鼠平均逃避潛伏期比較 與 PTU組比較，PTU + LA 組、PTU + L-T4 + LA 組、PTU +L-T4 組每天平均逃避潛伏期均縮短( P ＜ 0． 05 ) ; 與對照組比較，PTU + LA 及 PTU + L-T4 組逃避潛伏期雖比 PTU 組短，但前 2 d 逃避潛伏期比較有統(tǒng)計學意義( P ＜0． 05) ; PTU + L-T4 + LA 組逃避潛伏期比較無統(tǒng)計學差異( 圖 1) 。

2． 2． 1． 2 每日大鼠**次入水逃避潛伏期比較與 PTU 組比較，PTU + LA組、PTU + L-T4 + LA 組、PTU + L-T4 組每天**次入水逃避潛伏期均縮短，比較均有統(tǒng)計學意義( P ＜ 0． 05) ; 與對照組比較，PTU 組大鼠逃避潛伏期明顯延長，比較有統(tǒng)計學意義( P ＜0．05) ; 而 PTU 組、PTU + L-T4 組、PTU + LA +L-T4 組逃避潛伏期略長，但比較均無明顯統(tǒng)計學意義。與每日平均潛伏期比較結果基本一致。見圖2。

2． 2． 2 用重復測量設計的方差分析比較各組大鼠定位航向?qū)嶒灢町?nbsp;重復測量設計方差分析是目前對 Morris 水迷宮數(shù)據(jù)分析使用較多的方法，用一般線性模型( general linear model，GLM) 的重復測量過程實現(xiàn)重復測量資料的單變量方差分析，并用多因素方差分析過程實現(xiàn)每個時間點上組間的兩兩比較，判斷大鼠空間學習能力。本研究中，通過球形檢驗的結果為 P ＞ 0． 01( P = 0． 115) ，不拒絕球形假設，需校正 F 界值( 利用球?qū)ΨQ系數(shù)對自由度進行校正) 。分析表明，個體內(nèi)時間差異有統(tǒng)計學意義( F =29． 637，P ＜0． 001) ，逃避潛伏期隨時間變化縮短。但時間和分組的交互作用比較差異無統(tǒng)計學意義( F =1． 103，P =0． 357) ，表明時間因素不隨分組的不同而改變。組間變異比較有統(tǒng)計學意義( F =100． 637，P ＜ 0． 001) ，表明分組對大鼠逃避潛伏期有作用，5 組間大鼠每次入水逃避潛伏期比較均不同。與 PTU 組比較，**組大鼠逃避潛伏期均縮短，差異有統(tǒng)計學意義( P ＜ 0． 05) ，與對照組比較，PTU 組大鼠逃避潛伏期明顯延長，比較有統(tǒng)計學意義( P ＜0． 05) ，**組大鼠雖然逃避潛伏期縮短，但比較無明顯統(tǒng)計學意義Morris水迷宮對甲狀腺功能減退大鼠認知功能的影響 。

2． 2． 3 各組大鼠空間探索能力比較 各組大鼠在規(guī)定時間內(nèi)評價空間探索實踐的強度( 120 s 內(nèi)穿越原目標所在象限的時間、總路程、平均速度及穿越目標位置的次數(shù)、**次穿越目標所用時間) 。與 PTU組比較，PTU + LA 組、PTU + LT-4 + LA 組、PTU +L-T4 組各項指標均升高，比較有統(tǒng)計學意義 ( P ＜0． 01) ( 表 2) 。

2． 3 各組大鼠血清及海馬組織 MDA 含量和 SOD活性比較

與對照組比較，PTU 組 MDA 含量明顯升高( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 組與對照組比較，MDA 含量降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 組、PTU + LA + L-T4組分別與對照組比較，MDA 含量差異無統(tǒng)計學意義( 圖 3A、B) 。與對照組比較，PTU 組 SOD 活性明顯下降( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 組與對照組比較，SOD活性降低，二者差異有統(tǒng)計學意義( P ＜ 0． 05) ;PTU + LA 組、PTU + LA + L-T4 組分別與對照組比較，SOD 活性差異無統(tǒng)計學意義( 圖 3C、D)

3 討論

傳統(tǒng)觀點認為，甲狀腺**( T4) 在人體神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育過程中起重要作用。研究表明，甲狀腺功能減退引起**神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，致海馬區(qū)學習、記憶、注意力、執(zhí)行功能的受損，嚴重影響患者生活質(zhì)量。T4 替代**后，在 T4 及 TSH 水平恢復正常時，仍有部分患者持續(xù)存在認知功能受損。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在 PTU 誘導的甲減大鼠模型中，甲減可導致認知功能障礙，L-T4 替代**能部分逆轉(zhuǎn)甲減大鼠的認知功能。本研究通過對甲減大鼠進行抗氧化劑 LA 聯(lián)合 L-T4 替代**，觀察大鼠認知功能的恢復及與氧化應激相關酶的變化。

LA 作為自然界*強的天然抗氧化劑，被稱為“萬能抗氧化劑”，可增加多種組織( 包括大腦組織) 中的谷胱甘肽和其他內(nèi)源性抗氧化劑水平，對腦組織神經(jīng)細胞修復、神經(jīng)元再生及與腦細胞代謝有一定作用。LA 組單藥**與 PTU 組相比，對大鼠甲狀腺**無明顯作用，但是 LA 聯(lián)合 L-T4 替代**后，大鼠甲狀腺功能可基本恢復正常，同時對大鼠行為學檢測結果發(fā)現(xiàn)，無論 LA 單藥**抑或聯(lián)合 L-T4 都可使大鼠記憶能力改善。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧( ＲOS) 引起的氧化應激損傷是導致多種記憶損傷的關鍵因素，常用 SOD 活性及其代謝產(chǎn)物MDA 的含量等指標判斷氧化應激狀態(tài)。本研究在對與記憶有密切關系的海馬組織氧化應激相關酶學的檢測發(fā)現(xiàn)，LA 可使海馬 SOD 水平升高，MDA下降，通過**脂質(zhì)氧化及氧自由基，促進神經(jīng)元再生，**替代聯(lián)合抗氧化劑可使甲減大鼠學習記憶能力提高至正常大鼠基本相當水平，這與 de Chaves等的觀點相符。Morris水迷宮對甲狀腺功能減退大鼠認知功能的影響。

Morris 水迷宮實驗是研究空間學習記憶的標準實驗，過程包括: 適應性訓練、定位航向?qū)嶒?、空間探索能力。對于 Morris 水迷宮實驗，國內(nèi)外的研究較多，通過對大鼠逃避潛伏期的比較探討各組大鼠學習記憶能力，檢測較靈敏，數(shù)據(jù)誤差較小。研究表明，在水迷宮定位航向?qū)嶒炛?，大鼠入水象限不同、入水次序不同對大鼠記憶都有影響，因此，選擇合適的實驗方法及統(tǒng)計方法，對 Morris 水迷宮檢測大鼠記憶能力及空間認知功能起重要作用。有學者認為，每天第 1 次定位航行訓練的成績作為評價指標，可以反映出大鼠前 1 d 的記憶力。對大鼠5 d 的訓練發(fā)現(xiàn)，PTU 組大鼠訓練成績明顯較其余 4組差，PTU + LA 組與 PTU + L-T4 組大鼠**次入水逃避潛伏期有所波動，而 PTU + LT-4 + LA 組大鼠逃避潛伏期持續(xù)縮短，這種差異考慮可能與大鼠對周圍環(huán)境抗應激能力前 1 d 記憶能力有關，說明聯(lián)合用藥有助于大鼠學習記憶能力恢復。另有學者認為，把每天 4 次訓練平均成績作為評價記憶能力的指標，各組大鼠每天逃避潛伏期均較前 1 d 縮短，PTU 組逃避潛伏期明顯較當天其余組大鼠長，PTU +LA 組及 PTU + L-T4 + LA 組大鼠逃避潛伏期與對照組無明顯差異，說明抗氧化輔助**對大鼠長時記憶能力改善較顯著。另有近年較為新興的重復設計方差分析，動態(tài)觀察不同組別大鼠在每天不同時間點不同象限的水迷宮逃避潛伏期比較，過程雖復雜，但通過組內(nèi)及組間比較能較直觀地反映逃避潛伏期與時間及時間 × 組別的關系。本研究中所有組別大鼠逃避潛伏期均縮短，各**組分別與對照組及甲減組比較，個體時間比較有統(tǒng)計學意義，各**組大鼠學習記憶能力均較 PTU 組強，L-T4 及 LA 單獨用藥雖能改善記憶能力，但聯(lián)合用藥后有累加作用。說明 LA 可促進海馬區(qū)神經(jīng)元修復，改善記憶功能。因此，本研究為目前臨床**甲退患者輔助使用抗氧化劑提高生活質(zhì)量提供堅實依據(jù)。