合歡皮醇提液對(duì)焦慮小鼠明暗箱的行為學(xué)影響

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

合歡皮：豆科植物合歡 Silktree Albizia Bark 的干燥樹(shù)皮，原產(chǎn)地：湖北，規(guī)格：選，產(chǎn)品批號(hào)：121228，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教授陳隨清教授鑒定確認(rèn)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)藥典》2010 年版一部對(duì)合歡皮質(zhì)量要求。

***片：購(gòu)自河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，天津力生制藥股份有限公司，

規(guī)格：2.5mg。產(chǎn)品批號(hào)：1304006

乙醇：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM 小鼠，SPF 級(jí)，體重 20±2g,雄性。購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002，質(zhì)量證號(hào)：NO.41003100000236。分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度 20±2℃。

1.3 主要儀器

GZX-9070 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

ZDHW 型調(diào)溫電熱套：河北省黃驊市中興儀器有限公司；

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；

EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；

DZF-6020 型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

EL-S 電子天平：常州市天之平儀器設(shè)備有限公司；

XR-XB120小鼠明暗箱裝置:上海欣軟信息科技有限公司；

XR-XG201 高架十字迷宮裝置：上海欣軟信息科技有限公司；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 **制備

取 60g 合歡皮粉碎，加 80%乙醇，回流提取 2 次，每次 1h，過(guò)濾，合并濾液，濃縮揮干至無(wú)醇味浸膏，減壓干燥至粉末，加水溶解配制成所需濃度。

2.1 分組與給藥

SPF 級(jí)別小鼠 60 只，體重體重 20±2g,雄性，不限食水喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng) 3天，第四天稱重編號(hào)，按隨機(jī)分組軟件隨機(jī)分為五組，每組 12 只，分別為焦慮模型組，陽(yáng)性給藥組，合歡皮醇提液高、中，低劑量組，

模型組：ig 蒸餾水

陽(yáng)性組：ig ***水溶液（2.5mg/kg）

合歡皮醇提液高劑量組：ig 合歡皮醇提液（0.0633g/kg）

合歡皮醇提液中劑量組：ig 合歡皮醇提液（0.0315g/kg）

合歡皮醇提液低劑量組：ig 合歡皮醇提液（0.0153g/kg）

每天上午 8：30ig 給藥，給藥體積 0.1ml/10g,連續(xù) ig 給藥 5d.

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

Ig 給藥第 5d,按日常灌胃順序，每 5min 給藥，給藥 0.5h 后進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先將小鼠置于開(kāi)場(chǎng)中活動(dòng) 5min，然后將小鼠置于迷宮中央，使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開(kāi)放臂，用計(jì)算機(jī)跟蹤記錄小鼠在高架十字迷宮上的活動(dòng)情況，記錄時(shí)間為 5min。以小鼠開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OE%）即開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)/（開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)＋封閉臂進(jìn)入次數(shù)）和開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比（OT%）即開(kāi)放臂滯留時(shí)間/（開(kāi)放臂滯留時(shí)間＋封閉臂滯留時(shí)間）作為評(píng)價(jià)**抗焦慮作用的指標(biāo)。

2.2.2 明暗箱實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即進(jìn)行明暗箱實(shí)驗(yàn)，先使其自由活動(dòng) 5min，然后將小鼠背對(duì)暗室置于明室中央，觀察記錄 10min 內(nèi)小鼠在明暗箱內(nèi)的穿箱次數(shù)(TT)，以此作為評(píng)價(jià)**抗焦慮作用的指標(biāo)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的安靜和實(shí)驗(yàn)裝置的清潔從而減少外界環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
   型號(hào)：XR-XB120

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x—±s）表示；以 P<0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

由表 1 和圖 1 可以看出，與焦慮模型組比較，陽(yáng)性***組在開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（%）（OT%）和開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（%）（OE%）上均有顯著性差異( P＜0.05)，說(shuō)明焦慮模型造模成功，與焦慮模型組比較，合歡皮醇提液中劑量組能增加焦慮小鼠開(kāi)臂滯留時(shí)間，其余組在開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（%）（OT%），開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（%）（OE%）及穿箱次數(shù)（次）（TT）上均顯示出有一定的勢(shì)，無(wú)顯著性差異。

4 小結(jié)

由以上結(jié)果可以看出，僅合歡皮醇提液中劑量組在開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（%）（OT%）與焦慮模型組比較顯示出一定的顯著性差異（P＜0.05)，其余組并未表現(xiàn)出顯著性差異，合歡皮醇提液中劑量組可能有一定的抗焦慮作用，總體上合歡皮醇提液未顯示出有抗焦慮作用。

實(shí)驗(yàn)四 合歡皮抗焦慮活性部位的初步篩選研究

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

合歡皮：豆科植物合歡 Silktree Albizia Bark 的干燥樹(shù)皮，原產(chǎn)地：湖北，規(guī)格：選，產(chǎn)品批號(hào)：121228，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教授陳隨清教授鑒定確認(rèn)。

***片：購(gòu)自河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格：2.5mg。產(chǎn)品批號(hào)：1304006

氯仿：天津市登科化學(xué)試劑有限公司

乙酸乙酯：天津市登科化學(xué)試劑有限公司

正丁醇：天津市登科化學(xué)試劑有限公司

乙醇：天津市登科化學(xué)試劑有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM 小鼠，SPF 級(jí)，體重 20±2g,雄性。購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002，質(zhì)量證號(hào)：NO.41003100000236。分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度 20±2℃。

1.3 主要儀器

GZX-9070 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

ZDHW 型調(diào)溫電熱套：河北省黃驊市中興儀器有限公司；

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；

EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；

DZF-6020 型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

EL-S 電子天平：常州市天之平儀器設(shè)備有限公司；

XR-XB120小鼠明暗箱裝置:上海欣軟信息科技有限公司；

XR-XG201 高架十字迷宮裝置：上海欣軟信息科技有限公司；

TGL-16gR 型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；

JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；

微量移液器：北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

酶免儀（680 Microplate Reader，Bio-Rad Laboratories）；

γ-氨基丁酸(GABA)檢測(cè)試劑盒（由 R&D 生產(chǎn)，批號(hào) 20131101A）；

谷氨酸( Glu)檢測(cè)試劑盒（由 R&D 生產(chǎn)，批號(hào) 20131101A）；

五羥色胺(5-HT)檢測(cè)試劑盒（由 R&D 生產(chǎn)，批號(hào) 20131101A）。

氯化鈉注射液：河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：A12032601

全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：常熟儀器設(shè)備廠

分液漏斗；回流提取裝置

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 合歡皮水提物及其各萃取部位的制備

取合歡皮（粗粉）50g 水提 2 次，1h/次，趁熱過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至100ml,將濃縮液平均分為兩份，一份作為合歡皮水提物供藥理實(shí)驗(yàn)，另一份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得萃取液減壓濃縮至浸膏，各加水 50ml得合歡皮水提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物藥液，備用

2.1.2 合歡皮醇提物及其各萃取部位的制備

取合歡皮（粗粉）50g 用 95%乙醇回流提取 2 次，1h/次，趁熱過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏并揮至無(wú)醇味，取干燥浸膏分成兩份，分別加水 50ml,一份作為合歡皮醇提液，另一份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得萃取液減壓濃縮至浸膏，各加水 50ml 得合歡皮醇提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物藥液，備用。

2.1.3 分組與給藥

SPF 級(jí)別小鼠 100 只，體重體重 20±2g,雄性，不限食水喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)3 天，第四天稱重編號(hào)，按隨機(jī)分組軟件隨機(jī)分為 10 組，每組 10 只，分別給藥。連續(xù)給藥 5d。

焦慮模型組：ig 蒸餾水

陽(yáng)性組：ig ***水溶液（2.5mg/kg）

合歡皮水提液組：ig 合歡皮水提液（2.5g/kg）30

合歡皮水提液氯仿萃取物組：ig 合歡皮水提液氯仿萃取物（0.024g/kg）

合歡皮水提液乙酸乙酯萃取物組：ig 合歡皮水提液乙酸乙酯萃取物(0.025g/kg)

合歡皮水提液正丁醇萃取物組：ig 合歡皮水提液正丁醇萃取物（0.11g/kg）

合歡皮醇提物組：ig 合歡皮醇提物（0.0315g/kg）

合歡皮醇提物氯仿萃取組：ig 合歡皮醇提物氯仿萃取物（0.017g/kg）

合歡皮醇提物乙酸乙酯萃取組：ig 合歡皮醇提物乙酸乙酯物（0.084g/kg）

合歡皮醇提物正丁醇萃取組：ig 合歡皮醇提物正丁醇物（0.16g/kg）

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

Ig 給藥第 5d,按日常灌胃順序，每 5min 給藥，給藥 0.5h 后進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先將小鼠置于開(kāi)場(chǎng)中活動(dòng) 5min，然后將小鼠置于迷宮中央，使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開(kāi)臂，用計(jì)算機(jī)跟蹤記錄小鼠在高架十字迷宮上的活動(dòng)情況，記錄時(shí)間為 5min。以小鼠開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OE%）即開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)/（開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)＋封臂進(jìn)入次數(shù)）和開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（OT%）即開(kāi)臂滯留時(shí)間/（開(kāi)臂滯留時(shí)間＋封臂滯留時(shí)間）作為評(píng)價(jià)**抗焦慮作用的指標(biāo)。

2.2.2 明暗箱實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即進(jìn)行明暗箱實(shí)驗(yàn)，先使其自由活動(dòng) 5min，然后將小鼠背對(duì)暗箱置于明箱中央，觀察記錄 10min 內(nèi)小鼠在明暗箱內(nèi)的穿箱次數(shù)(TT)，以此作為評(píng)價(jià)**抗焦慮作用的指標(biāo)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的安靜和實(shí)驗(yàn)裝置的清潔從而減少外界環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2.3 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即斷頭處死于低溫下迅速取全腦，用萬(wàn)分之**平精密稱重，以腦組織（g）:生理鹽水（mL）=1:10 的比例加入低溫的生理鹽水，低溫下用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，勻漿液在 4℃，8000r/min 條件下離心 10min，取上清液置 5mL 離心管中，即得濃度為 10%的小鼠腦勻漿液，取腦勻漿液進(jìn)行酶聯(lián)**吸附法，分別測(cè)定腦組織中 GABA、Glu 和 5-HT 的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。試劑盒具體操作方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。結(jié)果判斷：31繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在 Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度OD 值作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按線性回歸曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。*終樣本濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)以 GABA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng) OD 值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，得曲線方程 A=0.1866C+0.1279(R2=0.9929)，表明濃度在 0μmol/L～8μmol/L 范圍內(nèi)，濃度與 OD 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

以 Glu 標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng) OD 值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，得曲線方程 A=0.0348C+0.1352(R2=0.9936)，表明濃度在 0mg/L～48mg/L 范圍內(nèi)，濃度與 OD 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

以 5-HT 標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng) OD 值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，得曲線方程A=0.0123C+0.0833(R2=0.9925)，表明濃度在 0ng/mL～120ng/mL范圍內(nèi)，濃度與 OD 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x—±s）表示；以 P<0.05為差異具有顯著性 

3 結(jié)果

3.1 合歡皮不同活性部位對(duì)焦慮小鼠行為學(xué)影響 

通過(guò)表 1 及圖 1 可以看出，與焦慮模型組比較，陽(yáng)性***組能增加焦慮小鼠開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（%）（OT%），開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（%）（OE%）及穿箱次數(shù)（次）（TT）。說(shuō)明焦慮模型造模成功，在開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（%）（OT%）上，與焦慮模型組比較，陽(yáng)性組、合歡皮水提液組、水提乙酸乙酯組、水提正丁醇組、合歡皮醇提物組、合歡皮醇提物正丁醇萃取物組均有顯著性差異（P<0.05）；在開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（%）（OE%）上，與焦慮模型組比較，陽(yáng)性組、合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇萃取組、合歡皮醇提正丁醇萃取組均有顯著性差異（P<0.05）；在穿箱次數(shù)（次）（TT）上，與焦慮模型組比較，僅陽(yáng)性**組有顯著性差異（P<0.05）。由此可以看出陽(yáng)性組、合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇萃取組、合歡皮醇提正丁醇組有一定的抗焦慮作用。

3.2 合歡皮抗焦慮活性部位對(duì)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi) GABA、Glu、5-HT 含量的影響

從表 1 及圖 1、2、3 中可以看出，與焦慮模型組比較，陽(yáng)性組、合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇部位、合歡皮醇提正丁醇部位均可提高小鼠腦內(nèi) GABA含量,降低小鼠腦內(nèi) Glu 含量，降低小鼠腦內(nèi) 5-HT 含量，其抗焦慮作用機(jī)制可能與其降低小鼠腦內(nèi)Glu、5-HT 含量，提高小鼠腦內(nèi) GABA 含量有關(guān)。

4 小結(jié)

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，合歡皮水提液組有抗焦慮作用，這驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，合歡皮水提正丁醇萃取物組與合歡皮醇提正丁醇萃取物組均有抗焦慮作用，可以說(shuō)明合歡皮抗焦慮有效部位為正丁醇部位。

實(shí)驗(yàn)五 合歡皮正丁醇部位木酯素含量測(cè)定

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀：美國(guó)；

Waters 2489 UV/Visible Detector：美國(guó)；

KQ3200B 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；

啟天 M7300 工作站：聯(lián)想公司；

十萬(wàn)分之**平：上海?？惦娮觾x器廠；

Acculab 電子天平：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司

SZ-93 自動(dòng)雙重蒸餾水：上海銀澤儀器設(shè)備有限公司；

1.2 主要試劑

合歡皮對(duì)照品：（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡

萄糖苷，136997-64-3，四川維克奇公司。

合歡皮正丁醇部位

乙腈：Dikma 公司，色譜純

甲醇：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純

磷酸：天津市登科化學(xué)試劑有限公司，色譜純

雙蒸水：實(shí)驗(yàn)室自制

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備：用十萬(wàn)分之**平精密稱取對(duì)照 20µg 置于 10ml 容量瓶中，加入 50%甲醇溶解，定容，搖勻，備用。

2.2 供試品溶液的制備 分別取合歡皮水提液和醇提液正丁醇粉末0.25g,精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入 50%甲醇 20ml,密塞，稱定重量，浸泡 1 小時(shí)，超聲處理（功率 250w,頻率 40kHz）30 分鐘，放冷，在稱定重量，用 50%甲醇補(bǔ)足夠、減失的重量，搖勻，濾過(guò)，經(jīng) 0.45µm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用，即得。

2.3 色譜條件：色譜柱 Symmetry○R C18(4.6 mm×250mm，5.0μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.04%磷酸水溶液（18:82），流速為 1ml·min-1, 柱溫 30℃，分析時(shí)間 40min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按照上述色譜條件，取對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣 2，4，6，8，10ul，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程：Y=42812X-2316 r=0.9998，線性范圍為 0.06-1.06µg。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，每次 20ul,測(cè)得 SAG 的峰面積，計(jì)算 RSD 為 1.3%，說(shuō)明儀器精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別在 0，2,4, 8,12h 進(jìn)樣 20ul,在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算含量的 RSD 為 1.5%，結(jié)果表明供試品溶液在 48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 經(jīng)計(jì)算醇提正丁醇中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷含量為 0.025%，水提正丁醇中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷為 0.015%合歡皮水提液醇提正丁醇及水提正丁醇中均含有（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷。木酯素在醇提正丁醇部位中含量高于水提正丁醇部位。

討論

1.合歡皮對(duì)焦慮小鼠行為學(xué)的影響

本文先從合歡皮水提液進(jìn)行抗焦慮研究實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明合歡皮水提液（2.5g/kg）對(duì)焦慮小鼠行為學(xué)有明顯的干預(yù)作用，合歡皮水提液（2.5mg/kg）有一定的抗焦慮作用，合歡皮的醇提液經(jīng)過(guò)多次調(diào)整劑量及多次抗焦慮小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)合歡皮醇提液具有抗焦慮作用，表明合歡皮抗焦慮有效部位可能在水溶性部位里，將合歡皮水提液和醇提物分別經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物分別進(jìn)行抗焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)合歡皮水提液正丁醇萃取物及合歡皮醇提物正丁醇萃取物均有較好的抗焦慮作用，合歡皮抗焦慮的有效部位為正丁醇部位，通過(guò)對(duì)小鼠腦內(nèi)遞質(zhì)含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其抗焦慮作用與提高小鼠腦內(nèi) GABA含量，降低小鼠腦內(nèi) Glu、5-HT 含量有關(guān)。合歡皮的正丁醇部位主要為木酯素類物質(zhì)，有報(bào)道表明其木酯素類成分為合歡皮****的主要成分，由此未來(lái)可以在已經(jīng)證明其正丁醇部位為有效活性部位的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究，在分離得到的正丁醇部位可以采用硅膠色譜法將其分離，在分離得到的物質(zhì)上繼續(xù)進(jìn)行抗焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確合歡皮抗焦慮的有效部位。

2.西醫(yī)學(xué)對(duì)焦慮癥的認(rèn)識(shí)

焦慮癥（Anxiety）又稱焦慮性神經(jīng)官能癥，是以廣泛和持續(xù)發(fā)作性焦慮或反復(fù)發(fā)作性驚恐不安為主要特征的神經(jīng)性障礙，常伴有自主神經(jīng)紊亂及運(yùn)動(dòng)性不安的病癥。根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為廣泛性焦慮（GAD）和驚恐障礙（PD）兩種主要形式。

焦慮癥患者常伴有頭暈、胸悶、心悸、呼吸急促、口干、出汗等植物神經(jīng)癥狀和運(yùn)動(dòng)性緊張。焦慮癥的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其生化機(jī)制與去甲腎上腺素、多巴胺、5——羥色胺、GABA 等多種遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)。

3.中醫(yī)對(duì)于焦慮癥的認(rèn)識(shí)

中醫(yī)中并不存在“焦慮癥”的說(shuō)法，從臨床癥狀上來(lái)看，焦慮癥屬于情志病、心病?？赡芘c中醫(yī)所說(shuō)的“郁證”、“驚”、“恐”、“驚悸”、“怔忡”、“不寐”、“臟燥”、“百合病”等病癥相似?；谥嗅t(yī)的診治整體觀和辯證施治原則，臨床上焦慮癥通常辯證分型**，中醫(yī)認(rèn)為，臨床焦慮癥有多種辯證分型，按病程可分為肝氣郁結(jié)型，氣郁化火型、痰熱上擾型、心脾兩虛型、心神不寧型等。

對(duì)于中醫(yī)辨證分型中的心神不寧型焦慮癥，可選用**類的中藥如酸棗仁、合歡皮、遠(yuǎn)志等或復(fù)方或單方進(jìn)行**，合歡皮為豆科植物合歡 Albizzia julibrissinDurazz.的樹(shù)皮，別名合昏皮（《備急千金**》）、夜合皮（《獨(dú)行方》）、合歡木皮（《本草綱目》）。合歡皮入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。《中國(guó)藥典》2010 版一部記載合歡皮性平味甘，歸心、肝、肺經(jīng)。解郁**，**消腫，可用于心神不安憂郁**，肺癰、瘡腫，跌撲傷痛。

4.焦慮動(dòng)物模型與合歡皮抗焦慮藥效學(xué)觀察

高架十字迷宮裝置和明暗箱裝置是目前行為學(xué)實(shí)驗(yàn)公認(rèn)的焦慮造模實(shí)驗(yàn)裝置。小鼠在高架十字迷宮裝置中會(huì)出現(xiàn)緊張、擔(dān)心、恐懼或發(fā)作性驚恐等種種焦慮行為，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)以進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比(OE%)（進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)/進(jìn)入開(kāi)臂膀次數(shù)+進(jìn)入閉臂次數(shù)）、開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比(OT%)（開(kāi)臂滯留時(shí)間/開(kāi)臂滯留時(shí)間+閉臂滯留時(shí)間）來(lái)反映動(dòng)物的焦慮狀態(tài)，當(dāng)小鼠放入高架十字迷宮和明暗箱時(shí)，焦慮小鼠的 OE%和 OT%明顯降低，經(jīng)典抗焦慮*****則使兩者升高，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)合歡皮水提液（2.5g/kg）、合歡皮水提液正丁醇萃取物（0.11g/kg）和合歡皮醇提物正丁醇萃取物（0.16g/kg）顯示出與***相似的作用,表現(xiàn)出較好的抗焦慮作用，明暗箱模型以明箱中的亮光作為刺激源，由于小鼠本身具有趨暗的習(xí)性，小鼠本能情況下的條件反射是向暗箱中爬行，當(dāng)它被置于明箱中時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出明顯的焦慮神經(jīng)癥的癥狀。小鼠在正常情況下更傾向于在暗箱一側(cè)活動(dòng)，但是當(dāng)小鼠焦慮癥狀減輕時(shí)，由于小鼠本身具有一定的對(duì)未知的探索性和好奇性，就會(huì)增加在明暗箱兩側(cè)來(lái)回穿梭次數(shù)以及在明箱一邊探尋行為的次數(shù)，用此來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮的程度。小鼠在明暗箱中穿梭次數(shù)越多，在明箱一側(cè)探尋次數(shù)越多，抗焦慮的效果越好。在本文章三次小鼠抗焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，明暗箱的穿箱次數(shù)（TT）顯示的效果不如高架十字迷宮 OE%和 OT%的效果好，可能與明暗箱是實(shí)驗(yàn)室自制的，需要靠人工來(lái)記錄穿梭次數(shù)存在一定的人為誤差有關(guān)。在未來(lái)的進(jìn)一步的抗焦慮實(shí)驗(yàn)中如果能將明暗箱更換為可自動(dòng)記錄穿梭次數(shù)的設(shè)置，明暗箱的實(shí)驗(yàn)效果可能會(huì)更好。也能更加均衡的反應(yīng)**的抗焦慮效果，在實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作中存在這樣的問(wèn)題，有時(shí)在一次實(shí)驗(yàn)中可能存在極少數(shù)小鼠進(jìn)入高架十字迷宮及明暗箱中完全沒(méi)有反應(yīng)，在處理數(shù)據(jù)中時(shí)摒除了這部分明顯不43正常的數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均衡可能存在部分的誤差。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，可考慮引入如開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等摒除部分明顯不正常的小鼠。避免對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤差。

5.抗焦慮作用機(jī)制探究

腦內(nèi)存在的氨基酸，不僅是合成多種蛋白質(zhì)的原料，同時(shí)還具有突觸傳遞功能。谷氨酸(Glu) 屬于興奮性氨基酸，在**興奮性氨基酸中占主導(dǎo)地位；γ-氨基丁酸(GABA)屬于抑制性氨基酸，是**神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在**神經(jīng)系統(tǒng)中，*重要的抑制性氨基酸是 γ-氨基丁酸，其在腦組織內(nèi)廣泛存在。GABA 與 Glu 是兩種作用幾乎完全相反的神經(jīng)遞質(zhì)，但在代謝途徑上卻具有相關(guān)性，GABA 是 Glu 在谷氨酸脫梭酶（GAD）的催化下脫梭而成的，對(duì) Glu 的釋放又可呈負(fù)反饋的抑制作用。40%以上的抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)由 GABA介導(dǎo)，GABA 可能通過(guò)激活受體而對(duì)離子通道構(gòu)成影響，造成突觸后膜超級(jí)化，抑制突觸后電位產(chǎn)生，抑制神經(jīng)元放電，從而發(fā)揮抗焦慮作用，因此 GABA 在控制神經(jīng)元興奮性方面，起著非常重要的作用。5-羥色胺（5-HT）廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，特別在大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高，屬于生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)的一種重要物質(zhì)。** 5-HT 系統(tǒng)功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致抑郁、焦慮、驚恐、強(qiáng)迫等多種精神障礙。

結(jié) 論

1.以合歡皮中木酯素含量為指標(biāo)，合歡皮水提液*佳工藝為 10 倍量的水，提取 2 次，每次 1.5h。

2.合歡皮水提液有明顯的抗焦慮作用，其抗焦慮作用機(jī)制與降低小鼠腦Glu、5-HT 含量，提高腦內(nèi) GABA 含量有關(guān)。

3.合歡皮醇提液抗焦慮作用效果不佳。

4.合歡皮正丁醇部位有明顯的抗焦慮作用，其抗焦慮作用機(jī)制與降低小鼠腦Glu、5-HT 含量，提高腦內(nèi) GABA 含量有關(guān)。木酯素類化合物可能為其抗焦慮有效成分。