大小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)方法的研究概況
【摘要】 本文對大小鼠游泳實(shí)驗(yàn)的方法(強(qiáng)迫游泳、負(fù)重游泳、水迷宮等) 、評(píng)價(jià)指標(biāo)(不動(dòng)時(shí)間、負(fù)重游泳時(shí)間、逃避潛伏期等)及模型大、小鼠生理生化的變化進(jìn)行了綜述，為進(jìn)行抗抑郁、抗疲勞和益智**的研究提供參考，本文還對計(jì)算機(jī)技術(shù)在大小鼠游泳實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用作了簡要的介紹。
【 關(guān)鍵詞】 大鼠; 小鼠; 游泳
大小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用于抗抑郁、抗疲勞和益智**的芍效學(xué)與作用機(jī)制研究的抗應(yīng)激實(shí)驗(yàn)方法。
本文就此作一個(gè)簡要的綜述，為相關(guān)**的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供參考。
1 大、小鼠游泳實(shí)驗(yàn)在抗抑郁**研究中的應(yīng)用
1977年，PorsoltRD**應(yīng)用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測抗抑郁**的作用。 后來強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)就成為評(píng)價(jià)**抗抑郁作用的動(dòng)物模型。
該實(shí)驗(yàn)方法是一種行為絕望實(shí)驗(yàn)法，其基本原理是當(dāng)大鼠或小鼠放進(jìn)一個(gè)有限的空間使之游泳，開始時(shí)拼命游泳力圖逃脫，很快就變成漂浮不動(dòng)狀態(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動(dòng)以保持身體不至于沉下去，實(shí)際是動(dòng)物放棄逃脫的希望，屬于行為絕望。
經(jīng)典的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分兩天進(jìn)行。 **天讓大鼠或小鼠在 25℃的深水中強(qiáng)迫游泳 15 min，取出后在32℃溫室烘干，歸籠。 **天，在同樣的條件下進(jìn)行強(qiáng)迫游泳 5 min，記錄不動(dòng)時(shí)間。 M
irua H 等將強(qiáng)迫游泳的時(shí)間改為(10 一30)min。 張中啟等在實(shí)驗(yàn)第 2 天直接觀察小鼠強(qiáng)迫游泳6 min 內(nèi)后4 min的不動(dòng)時(shí)間圖。 這些都是對經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法所做的修改。 大鼠或小鼠的不動(dòng)時(shí)間是判斷抗抑郁**作用的指標(biāo)。
不動(dòng)時(shí)間越短，抗抑郁作用越強(qiáng)。
水溫、水深、動(dòng)物、季節(jié)是影響實(shí)驗(yàn)的4 個(gè)因素。Kitada等指出水溫低于 20℃會(huì)縮短不動(dòng)時(shí)間。
因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)常常把水溫控制在25一 30℃。 水深的選擇應(yīng)以動(dòng)物無法逃脫為標(biāo)準(zhǔn)。 一般大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)水深為(17 一33)cm ，小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)水深約 10 cm 。 水太深，動(dòng)物難以使用前爪和尾保持不動(dòng)，就會(huì)游動(dòng)和攀爬。
水太淺，動(dòng)物可利用尾和后爪保持平衡而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 此外，不同品系的動(dòng)物對抗抑郁藥的敏感性不同。 W istar-kyOto。 品系大鼠比其它品系大鼠在游泳時(shí)更趨向于保持不動(dòng)狀態(tài)。
該實(shí)驗(yàn)受季節(jié)影響比較大，冬季動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間會(huì)延長，夏季則相反。 但游泳實(shí)驗(yàn)不存在時(shí)辰效應(yīng)，即**當(dāng)中不同時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是一致的。
Superfst強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置（上海欣軟信息科技有限公司提供）由攝像機(jī)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)宮體、攝像機(jī)支架、背光板、Superfst軟件5 部分組成，可自動(dòng)檢測小鼠的不動(dòng)時(shí)間。
Detke等將強(qiáng)迫游泳中的行為分成 4 類:游泳(動(dòng)物在水中四處游動(dòng))、攀爬(動(dòng)物前爪劃動(dòng)水面，碰觸缸壁)
、潛水(動(dòng)物整個(gè)身體沉于水下) 和不動(dòng)(動(dòng)物四肢不動(dòng)漂浮于水面，僅頭部露出水面呼吸) 。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明不同機(jī)制的抗抑郁藥影響不同的行為，如地昔帕明和馬普替林(NE 再攝取抑制劑)
可選擇性增加大鼠的攀爬行為，而氟西汀(5-HT 再攝取抑制劑)選擇性增加大鼠的游泳行為。
王斌等通過強(qiáng)迫游泳模型初步研究了柴胡皂昔和氟西汀的抗抑郁作用，發(fā)現(xiàn)柴胡皂昔單用難以起到抗抑郁作用，與氟西汀合用能加強(qiáng)其抗抑郁作用。
在強(qiáng)迫游泳刺激下，抑郁癥模型小鼠腦內(nèi)天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和?；撬?Tau)的含量都顯著升高，丙氨酸(Ala) 的含量顯著減少，谷氨酸(Glu)
和 Y-氨基丁酸(GABA ) 的含量沒有顯著性變化，表明強(qiáng)迫游泳可引起小鼠腦內(nèi)氨基酸水平的改變。 (其中Asp,Glu, Ala 為興奮性氨基酸，Gly, Tau,GABA 為抑制性氨基酸。) 陳瑤等通過比較興奮性/抑制性氨基酸二者比例的改變，發(fā)現(xiàn)抑郁癥模型小鼠腦內(nèi)興奮性/抑制性氨基酸的比值明顯降低，表明此時(shí)小鼠腦內(nèi)抑制性氨基酸的含量增加較顯著，**神經(jīng)系統(tǒng)以抑制占優(yōu)勢，與強(qiáng)迫游泳模型小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間長的抑郁行為較一致。
由此可見強(qiáng)迫游泳使小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間增加，出現(xiàn)抑郁傾向，可能與腦組織中興奮性氨基酸和抑制性氨基酸水平失調(diào)及興奮性/抑制性氨基酸的比值改變有關(guān)。 積雪草總昔就是通過改善抑郁癥模型小鼠腦內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)的失調(diào)，增加興奮性/抑制性氨基酸的比值，而減少強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，提高小鼠的興奮性，對抗強(qiáng)迫游泳所致抑郁傾向。
2 大小鼠游泳實(shí)驗(yàn)在抗疲勞**研究中的應(yīng)用
負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)**抗疲勞作用的動(dòng)物模型。 Moriura 等 曾用此實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)蝮蛇 (學(xué)名Agkistrodon
blomhoffiiblomhoffii Boie) 的50% 乙醇提取物的抗疲勞效應(yīng)。
常用的實(shí)驗(yàn)方法是將小鼠尾部 1/3一 2/3 處負(fù)重(體重的5% 一10% )后投人水槽中游泳，觀察和記錄小鼠自人水后到沉入水中
10 。不能浮出水面(處于力竭狀態(tài)) 的時(shí)間。 此負(fù)重游泳時(shí)間被看作是定量客觀評(píng)價(jià)疲勞程度的指標(biāo)。 若負(fù)重游泳時(shí)間越長，則表明**的抗疲勞效果越佳。 實(shí)驗(yàn)中水溫(
25 一29 土1)℃ ，水深約25 cm ， 所負(fù)重物為鉛絲或橡皮泥球。 無負(fù)重游泳也可以使小鼠疲勞，但觀察其達(dá)到力竭狀態(tài)所需的時(shí)間比較長。 嚴(yán)茂祥等建立了大鼠游泳致疲勞模型，其方法是將造模組大
鼠放人溫度為(43 土0.5)℃ ，水深為 35 cm 的水槽中，讓其自然游泳，以每只大鼠出現(xiàn)自然沉降的時(shí)間為每只大鼠的耐疲勞時(shí)間，當(dāng)全組
50% 大鼠出現(xiàn)自然沉降時(shí)，全組動(dòng)物停止游泳，造模連續(xù) 14 d。 模型成功后大鼠表現(xiàn)為:大便次數(shù)略增多、偏稀，體重稍下降，自由活動(dòng)減少，被毛略蓬松，食量下降。 近年來，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)也用于耐力的測試。
如果實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫調(diào)至(5~15土1)℃或(39~45士1)℃ ，使小鼠進(jìn)行高溫或低溫游泳，可以考察**對游泳致疲勞外加應(yīng)激的影響。
選用強(qiáng)制冷水游泳作為應(yīng)激源，在每天的不同時(shí)間造模，并改變每天造模持續(xù)時(shí)間，減少機(jī)體對應(yīng)激的耐受，力圖制造一個(gè)包括溫度刺激(寒冷) 、體力消耗(游泳) 以及精神刺激(強(qiáng)制冷水游泳所致情緒刺激)在內(nèi)的由多種應(yīng)激因素所致的應(yīng)激動(dòng)物模型。
它既模擬了中醫(yī)有關(guān)疲勞的發(fā)病過程，也符合西醫(yī)所認(rèn)為的由慢性應(yīng)激導(dǎo)致疲勞的理論。 模型動(dòng)物體力下降(力竭游泳時(shí)間縮短) ，出現(xiàn)抑郁傾向(自發(fā)活動(dòng)減少)、神經(jīng)***功能紊亂，這些與疲勞病人的癥狀表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查相似。
由此可見，該模型是一種值得進(jìn)一步提高和完善的可用以研究慢性疲勞的動(dòng)物模型。同時(shí)也說明在應(yīng)激導(dǎo)致慢性疲勞的過程與機(jī)體神經(jīng)一***一**系統(tǒng)功能的紊亂關(guān)系密切。
王琳等發(fā)現(xiàn)強(qiáng)制冷水游泳使大鼠血清中單胺類遞質(zhì)含量普遍出現(xiàn)升高趨勢，其中多巴胺含量明顯升高。 消疲怡神口服液(一種抗疲勞**)能降低 5-經(jīng)色胺(5-HT) 、多巴胺(DA
)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA )含量，并使 5-HT 代謝產(chǎn)物5-經(jīng)叫噪乙酸(5-HIAA )含量升高，提示其抗應(yīng)激作用可能與抑制外周 DA 的合成與代謝，促進(jìn) 5-HT 分解有關(guān)。 強(qiáng)制冷水游泳還會(huì)明顯降低大鼠腎上腺抗壞血酸含量(反映腎上腺皮質(zhì)功能的經(jīng)典指標(biāo))
，表明此時(shí)腎上腺功能活躍，皮質(zhì)酮合成增加。 消疲怡神口服液可以有效逆轉(zhuǎn)這一變化，提示它可以抑制應(yīng)激情況下腎上腺皮質(zhì)功能的過度活躍，減少腎上腺皮質(zhì)**的合成，減輕應(yīng)激所致的**影響。
乳酸(LAC) 、乳酸脫氫酶(LDH ) 、血清尿素氮(BUN ) ,葡萄糖(Glc)和總蛋白(TP)是與游泳致疲勞有關(guān)的血液生化指標(biāo)。
LAC 的堆積是運(yùn)動(dòng)性疲勞的一個(gè)重要原因。 LAC 作為無氧酵解的產(chǎn)物，長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)造成機(jī)體 LAC 堆積，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常代謝。 LDH 在 LAC 的代謝過程中起催化作用，運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期其活力的增加有利于
LAC 的消除。 BUN 是運(yùn)動(dòng)時(shí)物質(zhì)代謝的產(chǎn)物，它隨勞動(dòng)及運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而增加，機(jī)體對負(fù)荷適應(yīng)能力越差，BUN 的增量就越明顯。 G1。 存在于肌肉、紅細(xì)胞和
其它組織中，是運(yùn)動(dòng)的能量來源之一。 此外，蛋白質(zhì)含量能反映機(jī)體的營養(yǎng)狀況。 **可以通過降低運(yùn)動(dòng)后
LAC 水平和BUN 增量，提高LDH 活性及Glc 和TP 含量，來達(dá)到抗疲勞效應(yīng)。
游泳實(shí)驗(yàn)在中藥抗疲勞作用的研究中頻繁使用。 劉紅等以游泳小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)竹節(jié)人參可以提高
LDH 活力及肌糖原和肝糖原的儲(chǔ)備量，降低游泳后 LAC 水平和 BUN 增量，而具有抗疲勞作用。 賓曉農(nóng)等對絞股藍(lán)皂貳進(jìn)行藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)它可明顯延長小鼠游泳至力竭的時(shí)間;減少力竭性游泳小鼠心、腎組織中丙二醛(M
DA )含量;升高腎組織中超氧化物歧化酶(SOD )活性，使 SOD/M DA 比值相對增大。 由此提示絞股藍(lán)具有提高運(yùn)動(dòng)能力，抗疲勞，抗心、腎自由基損傷的作用。 楊柯等指出人參中的人參二醇組皂貳可以糾正長期遞增負(fù)荷游泳造成的大鼠血清皋酮明顯降低，是其抗疲勞作用的機(jī)制之一。
3 大、小鼠游泳實(shí)驗(yàn)在益智**研究中的應(yīng)用
游泳實(shí)驗(yàn)常用于學(xué)習(xí)記憶的研究，其方法包括M orri， 水迷宮、T 型水迷宮、方型水迷宮和
Y 型水迷宮。自1981年發(fā)明Morris水迷宮(M orriswatermace,M W M )以來，M W M 已成為從事學(xué)習(xí)記憶研究的學(xué)者們檢測嚙齒動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的主要工具之一。
學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)是條件反射，從動(dòng)物學(xué)習(xí)或執(zhí)行某項(xiàng)任務(wù)后間隔一定時(shí)間，測量其操作成績或反應(yīng)時(shí)間來衡量這些過程的儲(chǔ)存量、保留時(shí)間和它們所依賴的條件等。
M orris水迷宮由圓形水池和自動(dòng)錄像系統(tǒng)組成，水池池壁上 4 個(gè)等距離點(diǎn) N , E , S,W ，為試驗(yàn)起始點(diǎn)，分水池為4 個(gè)象限NE,SE,SW ,NW 。 任選一象限在中央放置平臺(tái)，大、小鼠游泳到此處爬上平臺(tái)可以得到休息，經(jīng)多次訓(xùn)練可以獲得記憶，通過行為檢測便可評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。
大、小鼠能否確定平臺(tái)完全由其空間學(xué)習(xí)能力所決定，因?yàn)樗貫閳A形，動(dòng)物只能通過水池周圍的參照線索來定位。 實(shí)驗(yàn)中要求參照線索豐富且保持不變。
用Morris水迷宮在行為檢測過程中常進(jìn)行兩項(xiàng)試驗(yàn):(1)定位航行試驗(yàn):試驗(yàn)開始前 1 d 將大鼠放人水池中(不含平臺(tái))。 自由游泳 2 min，讓其熟悉迷宮環(huán)境。 試驗(yàn)共歷時(shí) 5 d，每天分上、下午兩個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練
4 次，每天共 8 次。 訓(xùn)練開始時(shí)，將平臺(tái)置于 NW 象限，從四個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池， 自動(dòng)錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期) 和游泳路徑，4
次訓(xùn)練即將大鼠分別從四個(gè)不同起始點(diǎn)放人水中，大鼠找到平臺(tái)后或 120 s 內(nèi)找不到平臺(tái)則由實(shí)驗(yàn)者將其拿上平臺(tái)(潛伏期記為 120 s) ，在平臺(tái)上休息 30s，再行下次實(shí)驗(yàn)。
(2)空間探索試驗(yàn):在第5 天的第5次(緊接第4 次)撤除平臺(tái)，任選一人水點(diǎn)將大鼠面向池壁放人水中，記錄 1 min 內(nèi)大鼠在池中的游泳路徑、穿環(huán)數(shù)(跨原平臺(tái)所在位置的次數(shù))和在各象限的游泳距離占總距離的百分比。
龍大宏等用上述實(shí)驗(yàn)討論 了神經(jīng)生長 因子(NGF)對老年癡呆鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF
可以縮短逃避潛伏期，增加穿環(huán)數(shù)和原平臺(tái)象限的游泳距離占總距離的百分比。 由此提示 NGF能夠改善老年癡呆鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
目前國際上已有一種更為先進(jìn)、科學(xué)、真實(shí)的M orris全自動(dòng)水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司）。
該裝置主要有迷宮、攝像機(jī)記錄系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。 根據(jù)動(dòng)物在每一區(qū)花費(fèi)的時(shí)間，乘以規(guī)定的加權(quán)值，相加來計(jì)算學(xué)習(xí)記憶成績;潛伏期成績指動(dòng)物進(jìn)人迷宮到發(fā)現(xiàn)平臺(tái)所需要的秒數(shù)。
Morris全自動(dòng)水迷宮有如下優(yōu)點(diǎn):有 Video攝像系統(tǒng)，代替了研究者在迷宮試驗(yàn)時(shí)長時(shí)間肉眼觀察，不受任何人為因素誤差影響，更為客觀、真實(shí);使用微機(jī)系統(tǒng)和設(shè)計(jì)的程序，不僅能測定學(xué)習(xí)獲得成績、記憶保持成績，還能自動(dòng)在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示動(dòng)物的游泳軌跡。
劉新民等將小鼠在圓形水迷宮的學(xué)習(xí)記憶行為表現(xiàn)轉(zhuǎn)換為活動(dòng)圖像并顯示其實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)軌跡路線，利用計(jì)算機(jī)對獲得的信息資源進(jìn)行綜合分析，優(yōu)化組合后，建立了由運(yùn)動(dòng)距離、速度、尋找平臺(tái)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡組成的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)中采用高度為 30cm、直徑為 65 cm 的測試箱，底層設(shè)置加熱裝置，溫度控制器 自動(dòng)控制水溫(25℃ 一32℃可選)
，并將Mom s水迷宮方法中的白色攝像背景(水面顏色)調(diào)整為黑色以簡化實(shí)驗(yàn)操作和保證 目標(biāo)的準(zhǔn)確識(shí)別，采用多媒體視頻卡代替專用的圖像卡，以保證信號(hào)采集的實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性
